D型沙眼衣原体质粒蛋白pgp3的克隆、表达、鉴定及其免疫原性初探

孔杰 孙毅娜 赵乐然 肖萌 王敬 李卓然 刘原君 刘全忠

D型沙眼衣原体质粒蛋白pgp3的克隆、表达、鉴定及其免疫原性初探

孔杰 孙毅娜 赵乐然 肖萌 王敬 李卓然 刘原君 刘全忠

目的获得D型沙眼衣原体质粒蛋白pgp3基因及其蛋白,并鉴定其免疫原性。方法 PCR扩增目的基因,将其定向插入原核表达载体pGEX-6P-1中,连接产物转化入大肠埃希菌DH5α,提取质粒进行酶切、测序、PCR鉴定。再将重组质粒转化入大肠埃希菌BL21并诱导表达,Western印迹鉴定目的蛋白,谷胱甘肽巯基转移酶(GST)磁珠纯化pgp3-GST融合蛋白。用纯化后的蛋白免疫新西兰家兔,Western印迹检测抗体与pgp3蛋白的结合,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗体效价。结果克隆目的基因序列长度为795 bp,与基因库中一致,Western印迹显示目的蛋白相对分子质量为54 000,并得到纯化蛋白。所得兔血清可识别pgp3蛋白,ELISA检测多克隆抗体效价达1∶25 600。结论成功表达具有强免疫原性的pgp3-GST融合蛋白,为进一步研究奠定基础。

衣原体,沙眼;pgp3蛋白;重组融合蛋白质类;免疫法;疫苗,合成

越来越多的研究提示衣原体质粒是衣原体的毒力因子[1],它能够调节衣原体基因组基因的转录,在衣原体的致病过程中具有重要作用。在沙眼衣原体(Ct)各血清型中,该质粒结构高度相似,含有8个开放阅读框(ORF1-8)[2]。 Comanducci等[3-4]对 B、D、L1、L2四种血清型的Ct质粒核苷酸序列进行了对比分析,结果显示各血清型之间的变异率＜1%。由ORF5编码的pgp3蛋白是Ct中唯一由质粒编码的分泌性蛋白,本研究对pgp3蛋白进行分离和纯化,并检测其在动物体内的免疫原性,为进一步研究奠定基础。

材料与方法

一、质粒、菌株及动物

原核表达载体pGEX-6P-1由美国德克萨斯大学健康科学中心钟光明教授实验室赠送。大肠埃希菌DH5α、BL21,PCR模板(Ct D型标准株基因组)由本实验室保存。健康雄性新西兰家兔购于天津实验动物中心。

二、试剂

BamH I、Not I内切酶产自美国 Fermentans公司;零背景快速连接试剂盒、小鼠抗谷胱甘肽巯基转移酶(GST)单克隆抗体产自天根生化科技(北京)有限公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG、二氨基联苯胺(DAB)显色液产自北京中杉金桥生物技术有限公司;硝酸纤维素膜产自美国Pall公司;GST磁珠产自美国GenScript生物科技有限公司;RIPA蛋白裂解液、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)显色液产自北京索莱宝科技有限公司;还原型谷胱甘肽(GSH)覆盖的96孔酶标板由美国德克萨斯州大学健康科学中心钟光明教授实验室赠送。

三、pgp3基因扩增

自行设计的引物含有BamH I和Not I酶切位点,上游引物序列为5′-CGCGGATCCATGGGAAAT TCTGGTTTTTATTTG-3′, 下游引物序列为 5′-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTTAAGCGTTTGTTTGAGG TATTA-3′。PCR反应体系中含有上下游引物各1 μl,D 型标准株基因组 1 μl,PCR Mix 15 μl,DDW 12 μl。 扩增条件为：95℃ 3 min;95℃ 1 min,65℃1 min,68℃ 1 min,35个循环;72℃ 8 min。10 g/L琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。

四、重组质粒pGEX-6P-1/pgp3的构建

按说明书将PCR扩增产物连接到pZeroBack载体。用BamH I和Not I内切酶分别双酶切pZeroBack/pgp3和空质粒pGEX-6P-1,10 g/L琼脂糖凝胶电泳后回收酶切产物,用T4连接酶23℃作用2 h。将连接产物转化入大肠埃希菌DH5α,转化后挑取单个菌落进行扩增以提取质粒进行酶切、测序、PCR鉴定,基因测序由天根生化科技(北京)有限公司完成,测序引物为5′-GGGCTGGCAAGCCAC GTTTGGTG-3′。

五、pgp3-GST融合蛋白的表达和鉴定[5]

选取构建成功的重组质粒转化入大肠埃希菌BL21中,挑取BL21单克隆菌落进行增量培养,菌液加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),终浓度为1 μmol/L,诱导表达 40 min。4 ℃、5 438× g离心4 min收集菌体,PBS重悬,加溶菌酶、Triton-X 100裂解后超声破碎,4℃、12 235×g离心20 min后取上清进行Western印迹以鉴定融合蛋白的表达。Western印迹所用一抗为小鼠抗GST抗体,浓度为1∶1 000;二抗为HRP标记的羊抗小鼠IgG,浓度为1∶6 000,DAB显色液显色。

六、蛋白纯化

取100 μl GST磁珠放入1.5 ml离心管中,PBS(pH7.4)洗涤3次后加入1 ml上述上清,连续振荡1 h后PBS洗涤磁珠3次,加100 μl洗脱液(20 mmol/L GSH,0.05 mol/L Tris-Hcl,pH8.0)洗脱3次得到纯化的目的蛋白。将纯化蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western印迹鉴定。

七、免疫家兔[6]

选择体重2.5 kg的雄性新西兰家兔,用500 μg纯化后的pgp3蛋白与等体积弗氏完全佐剂乳化混合,背部多点皮下注射进行初次免疫。此后第2周、第4周取250 μg蛋白与弗氏不完全佐剂混合后经相同途径进行免疫。第3次免疫后1周耳缘静脉取血,所得血液于室温静置1 h后放于4℃冰箱过夜,4℃、825×g离心10 min,吸取上清分装备用。

八、Western印迹检测抗体与pgp3蛋白的结合

D型沙眼衣原体的培养见文献[7],衣原体培养48 h后,弃培养液,PBS清洗6孔板3次,每孔加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液200 μl,冰上作用30 min后用细胞刮将贴壁的细胞刮下,用1.5 ml离心管收集孔内全部液体,13 201×g离心10 min,收集管内上清。所得上清做SDS-PAGE后转移至硝酸纤维素膜,脱脂奶粉封闭后加抗体,一抗为兔血清(稀释比例为1∶100),二抗为HRP标记的羊抗兔IgG(稀释比例为1∶3 000),DAB显色液显色。

九、ELISA法检测抗体效价[8]

将未纯化的pgp3蛋白稀释后包被GSH覆盖的96孔酶标板。免疫后兔血清与BL21/pGEX-6P-1诱导表达后的菌体裂解液振荡混合1 h后倍比稀释作为一抗,二抗为HRP标记的羊抗兔IgG,浓度为1∶5 000。设置正常兔血清为一抗的阴性对照组和PBS为一抗的空白对照组。TMB显色,显色终止后酶标仪读取吸光度(A)450值,当(标本A值-空白A值)/(阴性对照A值-空白A值)≥2.1时判定为阳性。

结 果

一、pgp3基因的扩增

PCR扩增出单一特异性条带,与pgp3基因(795 bp)大小一致,见图1a。

图1 pgp3基因的扩增和重组质粒的鉴定 1a：pgp3基因的PCR扩增结果 1：标准参照物;2,3：PCR产物;1b：重组质粒pZeroBack/pgp3的酶切鉴定 1：酶切产物;2：标准参照物;1c：重组质粒pGEX-6P-1/pgp3的酶切鉴定 1：pGEX-6P-1/pgp3酶切产物;2：空质粒pGEX-6P-1酶切产物;3：标准参照物;1d：重组质粒pGEX-6P-1/pgp3中pgp3基因PCR扩增产物 1：标准参照物,2：PCR产物

二、重组质粒的构建与鉴定

重组质粒pZeroBack/pgp3经BamH I内切酶和Not I内切酶双酶切后电泳显示两条片段分别与载体(2 974 bp)和目的基因(795 bp)大小一致,见图1b。重组质粒pGEX-6P-1/pgp3经BamH I和Not I内切酶双酶切后,琼脂糖凝胶电泳显示酶切后的两个片段分别位于相当于载体(4 984 bp)和目的基因(795 bp)大小的位置,空质粒pGEX-6P-1酶切后仅有一条带,见图1c。测序分析发现pgp3基因序列与GeneBank中一致。同时以重组质粒为模版进行PCR扩增,产物为单一清晰条带,与pgp3基因大小一致,见图1d。

三、pgp3-GST融合蛋白的表达和鉴定结果

经测序鉴定含有重组质粒pGEX-6P-1/pgp3的BL21的菌液进行扩增培养并诱导表达,获取菌体沉淀,裂解后取可溶性蛋白进行Western印迹分析,在相对分子质量为54 000的位置有一条特异性条带,空质粒BL21/pGEX-6P-1和空菌BL21中均没有此条带;空质粒BL21/pGEX-6P-1在相对分子质量26 000位置附近出现GST表达条带,重组质粒和空菌BL21中均无此条带,见图2。

四、蛋白纯化结果

采用GST磁珠纯化目的蛋白,SDS-PAGE显示单一目的条带,Western印迹证实其为pgp3-GST融合蛋白,见图3。

五、Western印迹检测多克隆抗体结果

提取D型沙眼衣原体总蛋白,充分变性后进行转膜,检测兔血清中pgp3抗体。衣原体总蛋白在相对分子质量为26 000附近出现清晰条带,见图4。

六、抗体效价检测结果

用未纯化的pgp3蛋白包被覆盖GSH的96孔酶标板,间接ELISA法检测多克隆抗体效价为 1∶25 600。

图2 pgp3-GST融合蛋白的Western印迹鉴定 1：标准参照物;2：pgp3-GST 融合蛋白;3：BL21/pGEX-6P-1 表达产物;4：大肠埃希菌BL21表达产物

讨 论

由Ct引起的泌尿生殖道感染是世界范围内最流行的性传播疾病之一,其发病隐匿,反复迁延,持续的感染会导致女性盆腔炎症、宫外孕和输卵管性不孕,导致男性尿道炎和附睾炎。但是Ct的致病机制尚未明确,致病菌检出率低,抗生素耐药现象日益突出。本研究制备了在Ct致病过程中可能具有重要作用的基因及其抗体,为探索Ct致病机制及改进目前的诊断和治疗方法提供一定的线索。

Ct质粒编码8种蛋白,其中7种只存在于包涵体中,pgp3则能够分泌到宿主细胞的胞质中[1]。pgp3蛋白在衣原体感染宿主细胞12 h便可检测出,这种现象存在于所有种类的衣原体[9],推测pgp3蛋白对于衣原体在宿主细胞内的生长发育具有重要作用。衣原体在包涵体内进行代谢及复制,分泌到宿主细胞质的蛋白可能是联系衣原体和宿主细胞的媒介,因此构建表达Ct分泌蛋白对于推进Ct与宿主细胞相互作用的研究有一定的意义。

图3 纯化pgp3-GST融合蛋白的鉴定 3a：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定1：标准参照物;2：纯化蛋白;3b：Western印迹鉴定 1：标准参照物;2：纯化蛋白 图4 Western印迹检测多克隆抗体 1：标准参照物;2：沙眼衣原体总蛋白

用感染Ct的女性患者的抗体与8种质粒蛋白作用,所有的蛋白均可被至少一个抗体标本所识别,说明人体感染Ct后8种质粒蛋白均可表达[10],进而说明质粒在Ct感染人体时有一定的作用。Pgp3抗体普遍存在于Ct泌尿生殖道感染患者血清中[11],具有很高的敏感性和特异性,这些特点为沙眼衣原体的血清学检测及保护性免疫研究提供了线索,因此制备动物源性抗体有助于推进Ct诊断方法的改进和相关疫苗的研制。Li等[12]构建出pgp3的DNA疫苗,用其免疫Ct感染小鼠模型,发现接种疫苗组比对照组的小鼠输卵管病理变化明显减轻。

本研究采用的目的基因载体pGEX-6P-1带有GST-标签,GST为常用的可溶性蛋白标签,pgp3为分泌蛋白因此pGEX有助于它的可溶性表达。此外,GST可与GSH共价结合,利用这种特性可将pgp3-GST融合蛋白快速纯化。本研究采用GSH覆盖的96孔酶标板做ELISA,GSH可结合菌体裂解蛋白中GST,从而使pgp3-GST融合蛋白特异地结合到酶标板。同时,兔血清与BL21/pGEX-6P-1诱导表达后的菌体裂解液充分混合,血清中的GST抗体可与pGEX-6P-1表达的大量GST充分结合,从而避免了GST抗体对pgp3抗体滴度的影响。采用纯化后的蛋白免疫家兔,获得高效价的抗体,证实该蛋白具有良好的免疫原性。

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2013-06-13)

(本文编辑：尚淑贤)

Plasmid-encoded pgp3 protein ofChlamydia trachomatisserovar D:cloning,expression,identification,and evaluation of immunogenicity

Kong Jie*，Sun Yina，Zhao Leran，Xiao Meng，Wang Jing，Li Zhuoran，Liu Yuanjun，Liu Quanzhong.*Department of Dermatology and Venereology，Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052，China

Liu Yuanjun，Email:Liuyuanjun1980@126.com

ObjectiveTo express and identify the plasmid-encoded pgp3 protein ofChlamydia trachomatis(Ct)serovar D，and to evaluate its immunogenicity.MethodsThe pgp3 gene of Ct serovar D was amplified by PCR and directly inserted into the prokaryotic expression plasmid vector pGEX-6P-1 through the pZeroBack vector.Then，the recombinant plasmid pGEX-6P-1/pgp3 was transformed intoE.coliDH5α followed by enzymatic digestion，sequencing and PCR identification.After the identification，the recombinant plasmid was transformed intoE.coliBL21 followed by isopropyl-β-D-thiogalactoside(IPTG)induction.The expressed protein was identified by Western blot，and purified by glutathione S-transferase(GST)MagBeads.Male New Zealand rabbits were immunized with the purified protein for three times.Blood samples were collected from these rabbits one week after the last immunization and subjected to the qualification and quantification of anti-pgp3 polyclonal antibodies by Western blot and enzymelinked immunosorbent assay(ELISA)respectively.ResultsThe length of the cloned gene was 795 bp，which was consistent with the sequence of the pgp3 gene in GenBank.The recombinant fusion protein，whose relative molecular weight was 54 000，was successfully purified.The serum of immunized rabbits could react with the pgp3 protein，with the titer of anti-pgp3 polyclonal antibodies being 1 ∶25 600.ConclusionsThe pgp3-GST fusion protein with high immunogenicity is successfully expressed and purified，which may lay a foundation for further studies.

Chlamydia trachomatis;Protein，pgp3;Recombinant fusion proteins;Immunization;Vaccines，synthetic

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.05.008

国家自然科学基金(31100138、30901460、30671879)

300052天津医科大学总医院皮肤性病科(孔杰、赵乐然、肖萌、王敬、李卓然、刘原君、刘全忠);天津医科大学代谢病医院内分泌研究所(孙毅娜)

刘原君,Email：Liuyuanjun1980@126.com