Peutz-Jeghers综合征STK11基因突变研究

王昌媛 刘华 宗金宝 刘世国 史同新

Peutz-Jeghers综合征STK11基因突变研究

王昌媛 刘华 宗金宝 刘世国 史同新

目的探讨Peutz-Jeghers综合征(PJS)STK11基因突变情况,为该病基因诊断及遗传咨询提供依据。方法收集PJS 1个家系(2例患者)及1例散发病例,3例患者均有典型的皮肤黏膜黑褐斑和消化道多发息肉,提取PJS家系中2例患者、6名健康亲属及1例散发病例、100例健康对照的外周血基因组DNA,PCR扩增STK11基因的9个外显子及临近的内含子,对PCR结果进行DNA直接测序,测序结果与基因库中的STK11基因序列进行比对。结果家系中2例患者及1例散发患者STK11基因的9个外显子及临近内含子所有碱基未发现任何突变,家系中健康亲属及100例健康对照的STK11基因未发现突变。结论PJS存在遗传异质性,可能存在新的位点和致病基因。

Peutz-Jeghers综合征;基因,STK11;突变

Peutz-Jeghers综合征(PJS)又称黑斑息肉综合征(OMIM#175200)是一种少见的常染色体显性遗传性疾病,以消化道多发错构瘤性息肉、口唇黏膜黑褐色斑及恶性肿瘤高发为主要特征。其息肉可发生在消化道任何部位,以肠道为主,早期比较隐蔽,临床上常在反复出现阵发性腹痛、消化道出血、肠梗阻等严重并发症后才得以确诊,给患者带来极大痛苦。黑褐色斑亦可发生于面部、手足、口腔内及外生殖器等部位皮肤黏膜,影响患者美观。调查发现PJS患者消化道及消化道外肿瘤的发生率显著增高,约为普通人群的9～18倍,患者一生中各种癌症累积风险为 93%［1］。1998年 Hemminki和 Jenne等研究证实,位于19p13.3的STK11基因(NG_007460,又称LKB1基因)是PJS重要的致病基因［2-3］。目前在人类基因突变数据库(human gene mutation database,HGMD)中已鉴定出的STK11基因致病突变共有200多种,但以往研究表明,部分PJS患者检测不到该基因的突变［4］。本研究通过DNA测序的方法对收集的1个PJS家系及1例散发的PJS病例进行基因突变检测,以期发现是否存在STK11基因的致病突变。

对象与方法

一、临床资料

图1 家系图

图2 先证者的临床表现 2a:口腔内黏膜黑褐色斑;2b:手指末端散在分布5 mm大小黑褐色斑;2c:胃镜显示胃体部息肉

图3 散发病例的临床表现 3a:患者唇部散在分布1～2 mm大小黑褐色斑;3b:肠镜显示的肠道息肉

收集的1个PJS家系(图1)共3代9人,患者3例。先证者,女,35岁,2岁时家长发现口唇出现针尖大小的黑褐色斑点,并逐渐累及口腔黏膜和手指末端,黑褐色斑无季节变化,无明显自觉症状。患者近5年出现间断性腹痛、便血,1年前行胃镜、结肠镜等检查显示胃、十二指肠、结肠多发性息肉,组织病理示增生性息肉,经内镜切除部分息肉后,腹痛、便血等症状减轻。皮肤科检查见唇部、口腔内黏膜及手指末端散在1 mm至5 mm大小黑褐色斑,手指末端的黑褐色斑数量少,但单个面积较大(图2)。先证者的父母非近亲结婚,父亲已去世(死因不详),先证者回忆其父口唇部有黑褐色斑点,先证者育有1女1子,女儿7岁,2岁时口唇出现类似黑褐色斑,目前未出现胃肠道症状,儿子3岁,皮肤黏膜未发现黑斑。收集的1例散发病例,女,28岁,1岁时发现口唇出现黑褐色斑,后累及双手手指(图3)。1年前出现腹痛、便血,3个月前在消化内科住院,行胃镜、肠镜及组织病理检查示消化道多发性腺瘤样息肉并部分切除。健康对照组来自青岛大学医学院附属医院山东省代谢性疾病重点实验室保存的100例健康人外周血。本研究经过医院伦理委员会批准,患者签署知情同意书。

二、方法

1.外周血DNA的提取:抽取家系中2例患者、6例健康亲属及1例散发病例的静脉抗凝血各5 ml,用Tiangen产DNA提取试剂盒(离心柱型)提取患者与健康对照的基因组DNA。利用Nanodrop2000微量紫外分光光度计(Thermo Scientific)对提取的DNA进行纯度和浓度检测。

2.PCR扩增:用Primer Premer5软件设计引物扩增STK11基因第1～9外显子,由北京Invitrogen公司合成引物。PCR反应体系为25 μl,包括2×Power Taq PCR Master Mix 12.5 μl、上下游引物(10 μmol/L)各1 μl、DNA 模板(50 ng/μl)2 μl、灭菌双蒸水 8.5 μl。PCR参数:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,60℃～68℃退火30 s(表1),72℃延伸45 s,进行35个循环后72℃延伸10 min,再逐渐降至4℃。

3.PCR扩增产物测序:PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离,利用UVP凝胶成像仪进行图像扫描,于相应位置处见单一条带。PCR产物送至上海申速生物有限公司进行直接测序。

表1 PCR引物序列及扩增片段长度及退火温度

结 果

一、PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果

STK11基因全部外显子经PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定,在相应分子量位置扩增条带其产物片段大小与预期相符(图4),清晰单一,特异性良好,进行DNA测序。

二、STK11基因全部外显子DNA测序结果

测序结果与STK11基因的正常序列进行比对分析(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/),家系中 2 例患者及1例散发患者STK11基因的9个外显子及邻近内含子的DNA序列均未发现任何碱基的突变。家系中6例健康亲属及100例健康对照者STK11基因的9个所有外显子及邻近内含子的DNA序列未发现任何碱基的突变。

讨 论

研究选取的所有患者均经过皮肤科和消化内科医师的确诊,符合2010年消化系统肿瘤WHO分类中推荐的PJS诊断标准:①组织学上证实PJ息肉≥3个;②有PJS家族史,且出现PJ息肉(不管数量多少);③存在典型而显著的皮肤黏膜色素沉着,并有PJS家族史;④任何数量的PJ息肉并且有显著的皮肤黏膜色素沉着(符合以上任何一条标准即可诊断)。国外研究资料统计,有家族史的PJS患者STK11基因突变的检出率为70%～80%,散发病例检出率为25%［5］,认为PJS存在遗传异质性,可能存在新的位点和致病基因。文献显示中国人PJS患者的STK11基因突变率更低,约占33.3%［6］。本研究中PJS家系中2例患者及1例散发病例均未检测出STK11基因的所有外显子及邻近内含子的突变,也进一步证实了这一现象。STK11基因编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是一种抑癌基因,包含3个主要区域,N端催化区域激酶、激酶催化区域和C端调节区域。

图4 PCR结果 M:标准参照物;1～9:STK11基因9个外显子

分析一部分PJS患者检测不到的原因可能为:①PJS存在遗传异质性,有待研究发现新的位点,克隆新的致病基因。2004年Jiang等［7］对10个无STK11基因突变的PJS家系进行了STK13的基因研究,但未检测到致病的基因突变。下一步我们可以收集无STK11基因突变的较大的PJS家系进行连锁分析,寻找新的致病位点;②STK11基因的致病突变位点不在外显子区域,而在包含启动子的非编码序列。易鑫等［8］对15个来自不同家系的PJS患者进行了STK11基因启动子-1160至-1543区间的突变分析,发现一SNP位点(-1275)G→T,认为是PJS的易感因素,但没有大样本数据的验证;③STK11基因表达调控的过程中出现异常,2010年康晓静等在一PJS家系中发现息肉组织STK11基因外显子8的一个新的杂合突变,而在患者外周血中未发现此突变［4］;④PJS患者的STK11基因存在大片段的缺失,应用常规的基因测序方法无法检测出。Volikos等用多重连接探针扩增技术(Multiplex Ligation dependent Probe Amplification，MLPA) 检测常规测序方法未发现STK11基因突变的PJS患者,发现STK11基因种系突变率大约为80%,远高于常规测序方法的检出率［9］。

尽管已经对PJS的基因进行了深入研究,但因为其致病基因的复杂性,还需要收集更多的样本对上述原因展开进一步的研究。

［1］van Lier MG，Westerman AM，Wagner A，et al.High cancer risk and increased mortality in patients with Peutz-Jeghers syndrome［J］.Gut，2011，60：141-147.

［2］Hemminki A，Markie D，Tomlinson I，et al.A serine/threonine kinase gene defective in Peutz-Jeghers syndrome ［J］.Nature，1998，391：184-187.

［3］Jenne DE，Reimann H，Nezu J，et al.Peutz-Jeghers syndrome is caused by mutations in a novel serine threonine kinase［J］.Nat Genet，1998，18：38-43.

［4］康晓静，田艳，高峰，等.Peutz-Jeghers综合征STK11基因突变研究［J］.中华皮肤科杂志，2010，43(4)：263-265.

［5］Amos CI，Keitheri-Cheteri MB，Sabripour M，et al.Genotypephenotype correlations in Peutz-Jeghers syndrome ［J］.J Med Genet，2004，41(5)：327-333.

［6］李宜雄，吕新生，夏家辉，等.STK11基因突变在中国人Peutz-Jeghers综合征中的特征［J］.中华医学遗传学杂志，2001，18(1)：4-7.

［7］Jiang JG，Li YX，Xia JH，et al.STK13 gene mutation in Chinese Patients with Peutz-Jeghers syndrome［J］.Chin J Dig，2004，24：583-585.

［8］Yi X，Yao MJ，Wang YJ，et al.Sequence polymorphism of the promoter region of gene STK11 in patients with Peutz-Jeghers syndrome［J］.Zhong Nan Da Xue Xue Bao(Yi Xue Ban)，2007，32(1)：74-77.

［9］Volikos E，Robinson J，Aittomäki K，et al.LKB1 exonic and whole gene deletions are a common cause of Peutz-Jeghers syndrome［J］.J Med Genet，2006，43(5)：e18.

2013-03-05)

(本文编辑:吴晓初)

Mutation analysis of STK11 gene in patients with Peutz-Jeghers syndrome

Wang Changyuan*，Liu Hua，Zong Jinbao，Liu Shiguo，Shi Tongxin.*Department of Dermatology，Qingdao Municipal Hospital，Qingdao 266011，China

Shi Tongxin，Email：shitx2006@163.com

ObjectiveTo study the mutation of STK11 gene in a Chinese family and a sporadic patient with Peutz-Jeghers syndrome(PJS)，and to provide a basis for genetic diagnosis and counseling.MethodsOne sporadic patient and two patients from a family with PJS were collected，all of whom had typical mucosal pigmentation and gastrointestinal polyposis.Blood samples were obtained from the two patients and six unaffected relatives in this family，the sporadic patient，and 100 healthy controls.DNA was extracted，and PCR was performed to amplify nine exons and their adjacent introns in the STK11 gene followed by direct sequencing.The sequencing results were aligned to the published sequence of STK11 gene from Genbank.ResultsNo mutation was found in the STK11 gene of any of the patients，unaffected relatives，or healthy controls.ConclusionsGenetic heterogeneity exists in Peutz-Jeghers syndrome，hinting that there may be other causative genes or sites for this entity.

Peutz-Jeghers syndrome；Gene，STK11；Mutation

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.01.012

青岛市卫生科技计划(2010-ws20011)

266011青岛市市立医院皮肤科(王昌媛、史同新);青岛大学医学院附属医院消化内科(刘华);青岛大学医学院附属医院检验科(宗金宝),山东省代谢性疾病重点实验室(刘世国)

史同新,Email:shitx2006@163.com