人真皮间充质干细胞对白癜风患者皮损周围CD8+T淋巴细胞表达和分泌白介素13的影响

鲍华烨 周妙妮 许爱娥

人真皮间充质干细胞对白癜风患者皮损周围CD8+T淋巴细胞表达和分泌白介素13的影响

鲍华烨 周妙妮 许爱娥

目的探讨人真皮间充质干细胞(DMSC)对白癜风患者皮损周围CD8+T淋巴细胞分泌表达白介素(IL)13的影响。方法细胞增殖检测法(MTS)检测重组IL-13(rIL-13)对黑素细胞增殖的影响。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹法分别检测6例进展期寻常型白癜风患者皮损周围及外周血中CD8+T淋巴细胞中IL-13基因和蛋白表达。实时荧光定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)技术和酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测DMSC与白癜风患者皮损周围CD8+T淋巴细胞共培养前后细胞IL-13 mRNA水平和上清蛋白水平。结果不同浓度(10、50、100、250、500 μg/L)的 rIL-13 作用黑素细胞 24、48、72、96 h 后黑素细胞的增殖与对照组比较均未见明显变化(均P＞0.05)。白癜风患者皮损周围及外周血中CD8+T淋巴细胞均可表达IL-13,但皮损周围CD8+T淋巴细胞表达IL-13更显著。将皮损周围CD8+T淋巴细胞和DMSC共培养,CD8+T淋巴细胞IL-13 mRNA(0.100 0±0.002 4)和蛋白［(1 509.62±48.44)ng/L］的表达水平均显著低于单独培养的CD8+T淋巴细胞［mRNA:0.383 2±0.018 7,蛋白:(5 507.98±34.11)ng/L,均P＜0.05］。结论白癜风患者皮损周围CD8+T淋巴细胞高表达IL-13,DMSC能够有效地抑制其表达IL-13,或许可作为白癜风的治疗靶点之一。

白癜风;CD8阳性T淋巴细胞;间质干细胞;白细胞介素13

白癜风是一种获得性色素脱失性疾病,该病发病机制不明,治疗困难。研究表明,白癜风皮损周围真皮浅层内存在大量的CD8+T淋巴细胞浸润,浸润的淋巴细胞具有黑素细胞抗原特异性,能选择性杀伤黑素细胞并引起角质形成细胞凋亡,从而造成正常皮肤的色素减退［1］,可能是白癜风的发病机制之一,因此抑制白癜风皮损部位CD8+T淋巴细胞的活性,调节皮损部位的免疫微环境,可能是治疗白癜风的重要手段。间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是一类能够自我更新,具有多向分化能力的干细胞。有研究表明,MSC可诱导活化的T细胞凋亡［2］。我们前期［3］已经将人真皮来源的间充质干细胞(dermal mesenchymal stem cell，DMSC)和白癜风患者CD8+T淋巴细胞共同培养,发现DMSC抑制患者CD8+T淋巴细胞的活性和增殖,并促进其凋亡,而且患者皮损周围CD8+T淋巴细胞和DMSC共同培养后,多种细胞因子分泌下降,其中白介素(IL)-13的下降较为显著［3］。本研究以IL-13为靶点,旨在研究IL-13在DMSC和白癜风患者皮损周围CD8+T淋巴细胞介导的免疫反应中可能发挥的作用。

材料与方法

一、材料

1.主要试剂和仪器:Trizol试剂购自美国Invitrogen公司,淋巴细胞分离液购自美国Sigma-Aldrich公司,MACS分选磁珠购自德国Miltenyi公司,SYBR® Premix Ex TaqTM购自日本TaKaRa公司,2×Taq Master Mix、细胞增殖与毒性检测试剂盒(MTS)均购自美国Omega公司,重组IL-13和抗IL-13单克隆抗体及IL-13 ELISA试剂盒购自美国RD公司。梯度PCR仪购自德国Eppendorf公司,CFX96实时荧光定量PCR仪系美国Bio-Rad公司产品。

2.PCR引物序列:①IL-13,上游5'-ATTGCTC TCACTTGCCTTGG-3',下游5'-CAGGTTGATGCTCC ATACCA-3;②肌动蛋白,上游5'-GTCTTCCCCTCC ATCGTG-3',下游 5'-AGGGTGAGGATGCCTCT CTT-3'。

二、方法

1.CD8+T淋巴细胞的分离和培养:6例寻常型白癜风进展期患者中男4例,女2例,年龄18～50岁(平均29岁)。排除伴发甲状腺功能亢进、糖尿病、红斑狼疮、特应性皮炎、斑秃等自身免疫性疾病者。试验方案经医院伦理委员会批准,患者均签署知情同意书。皮损周围CD8+T淋巴细胞的分离和培养:取患者白斑边缘的皮肤组织0.5 cm×1.0 cm,去除皮下组织,切成小块(0.1～0.2 cm2),置于含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基,添加抗CD3/CD28抗体磁珠,放入37℃,5%CO2的细胞培养箱内培养。外周血CD8+T淋巴细胞的分离和培养:抽取患者外周血,用淋巴细胞分离液分离获得外周血单一核细胞(PBMC),将PBMC进行磁珠分选获得CD8+T淋巴细胞,添加抗CD3/CD28抗体磁珠,置于RPMI1640完全培养基中,放入细胞培养箱内培养。取对数生长期细胞用于实验。

2.DMSC的分离和培养:标本取自本院泌尿外科健康男性包皮环切术后表皮组织,剪成小片。用分离酶4℃消化分离表真皮,真皮用0.35%的胶原酶Ⅰ37℃振荡消化,再加入DNA酶37℃消化后,获得细胞悬液,接种于含DMSC培养基的培养皿中,置于5%CO2培养箱37℃孵育。经鉴定［4］此细胞符合间充质干细胞的特点,取对数生长期细胞用于实验。

3.皮损周围CD8+T淋巴细胞和DMSC共培养:参考之前的研究［4］,将 DMSC(细胞浓度为 5×105/ml)接种于6孔板,培养24 h后,每孔加入新鲜分离纯化的CD8+T淋巴细胞(细胞浓度为1×106/ml,1∶2)共培养,同时加入抗CD3/CD28抗体磁珠刺激生长,对照组为皮损周围CD8+T淋巴细胞单独培养,空白组为DMSC单独培养。72 h后收集细胞和上清。

4.黑素细胞的分离和培养:标本取自我院泌尿外科健康男性包皮环切术后表皮组织,分离表真皮,表皮以胰蛋白酶和乙二胺四乙酸孵育10 min,离心,重悬细胞,培养3 d后加入基因素以去除角质形成细胞和成纤维细胞,继续培养。取对数生长期细胞用于实验。

5.重组IL-13(rIL-13)对黑素细胞增殖影响的测定:参考 Choi等［5］的方法,用 MTS 法,调节黑素细胞浓度至5×103/ml,以100 μl/孔接种于96孔板,培养24 h后,分别加入100 μl rIL-13浓度为10、50、100、250、500 μg/L 的黑素培养基, 对照组只加培养基,每组设6个复孔,实验重复3次。分别培养24、48、72、96 h 后终止培养, 分别向对照组、rIL-13处理组每孔加入20 μl MTS溶液,孵育3 h,酶联免疫分析仪490 nm处测吸光度值(A)。细胞增殖率=rIL-13处理组A490/对照组A490×100%。

6.反转录(RT)-PCR检测IL-13基因的表达:按照Trizol说明书分别提取皮损周围和外周血CD8+T淋巴细胞总RNA,紫外分光光度计测定RNA纯度和浓度。反转录制备cDNA,RT反应条件:65℃ 10 min,55℃ 30 min,85℃ 5 min。PCR扩增体系包括 12.5 μl 2×Taq Master Mix,1.0 μl引物,2 μl cDNA 模板,9.5 μl无核酸水。反应条件:95℃预变性5 min;95℃变性40 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,35个循环;72℃延伸7 min。反应结束后,取反应液进行电泳,确认PCR反应产物。

7.实时荧光定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测IL-13 mRNA的表达:提取并逆转录皮损周围CD8+T淋巴细胞、DMSC及两者共培养后的CD8+T淋巴细胞。PCR扩增体系包括cDNA模板2μl,引物 1.0 μl,SYBR Premix Ex TaqTM12.5 μl,dH2O 9.5 μl,扩增条件:预变性95℃ 30 s;95℃ 5 s,60℃30 s,共40个循环,在每个循环结束前用LightCycle系统自动检测荧光产物的量。在实时荧光定量PCR仪上读取扩增曲线、熔解曲线和Ct值。

8.Western印迹法检测IL-13蛋白表达:提取皮损周围和外周血CD8+T淋巴细胞总蛋白-70℃保存。蛋白定量,煮沸变性,电泳并湿转转膜,封闭,分别加入抗IL-13抗体及β肌动蛋白抗体,4℃摇床上过夜,洗膜,分别加二抗1 h,洗膜,曝光显影。以β肌动蛋白作为内参照,用ImageJ图像分析软件分析目的蛋白灰度值。

9.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-13蛋白的表达:收集皮损周围CD8+T淋巴细胞、DMSC及两者共培养后的CD8+T淋巴细胞的上清液,用双抗体夹心ELISA法检测上清液中IL-13的含量,实验步骤严格按试剂盒说明书操作。

10.统计学方法:用SPSS 17.0统计软件对实验结果进行t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、rIL-13对黑素细胞增殖的影响

通过MTS检测发现,用浓度分别为10,50,100,250 μg/L 的 rIL-13 处理黑素细胞 24、48、72、96 h,各处理组黑素细胞的增殖与对照组相比,均P＞0.05,差异无统计学意义,可见,rIL-13对黑素细胞的增殖无明显影响(表1)。

表1 不同浓度重组白介素-13(rIL-13)对黑素细胞增殖的影响(±s)

表1 不同浓度重组白介素-13(rIL-13)对黑素细胞增殖的影响(±s)

注:n=3,将不同时间点各浓度rIL-13组和对照组比较,均P＞0.05

组别 24 h 48 h 72 h 96 h rIL-13组10 μg/L 1.1728±0.0497 1.3953±0.0300 1.6888±0.0035 1.7577±0.0564 50 μg/L 1.2108±0.0328 1.4210±0.0233 1.7257±0.0645 1.8067±0.1272 100 μg/L 1.2100±0.0163 1.3977±0.0265 1.6677±0.0363 1.8500±0.0838 250 μg/L 1.2100±0.0163 1.4403±0.0537 1.7023±0.0242 1.8317±0.0976对照组 1.2070±0.0820 1.4237±0.0295 1.6990±0.0121 1.8437±0.0451

图1 白介素(IL)-13在两组CD8+T淋巴细胞的表达 1a:逆转录(RT)-PCR产物电泳图;1b:Western印迹结果。M:标准参照物;1:患者皮损周围CD8+T淋巴细胞;2:患者外周血CD8+T淋巴细胞

二、IL-13在白癜风患者皮损周围及外周血CD8+T淋巴细胞中的表达

RT-PCR产物电泳示,白癜风患者皮损周围及外周血CD8+T淋巴细胞均扩增出大小约为150 bp的IL-13基因条带,提示两种来源的CD8+T淋巴细胞均表达IL-13基因,并且皮损周围CD8+T淋巴细胞条带亮于外周血CD8+T淋巴细胞,表明皮损周围CD8+T淋巴细胞表达IL-13 mRNA更显著(图1a)。Western印迹示,白癜风患者皮损周围及外周血CD8+T淋巴细胞均可见到相对分子质量17 000的IL-13蛋白特异性条带,且皮损周围CD8+T淋巴细胞条带更明显,皮损周围及外周血CD8+T淋巴细胞的IL-13蛋白/β肌动蛋白灰度值比值分别为0.712±0.035和0.225±0.023,两组细胞相比,差异有统计学意义(t=16.223,P＜0.05),结果表明,皮损周围CD8+T淋巴细胞表达IL-13蛋白更显著(图1b)。

三、DMSC抑制患者皮损周围CD8+T淋巴细胞IL-13基因和蛋白的表达

qRT-PCR结果显示,和DMSC共培养后的患者皮损周围CD8+T淋巴细胞IL-13 mRNA表达水平(0.1000±0.0024)明显低于单独培养的皮损周围CD8+T淋巴细胞(0.3832±0.0187),t=37.654,P＜0.05。DMSC抑制CD8+T淋巴细胞分泌IL-13,而其本身几乎不表达IL-13(0.0064±0.0006)。ELISA结果显示,患者皮损周围CD8+T淋巴细胞与DMSC共培养后,IL-13的表达水平(1509.62±48.44)ng/L显著低于单独培养的皮损周围CD8+T淋巴细胞(5507.98±34.11)ng/L(t=98.321,P＜0.05)。DMSC很少表达IL-13蛋白［(316.57±1.99)ng/L］。

讨 论

已经证实白癜风患者皮损周围有大量黑素细胞抗原特异性CD8+T淋巴细胞浸润,淋巴细胞的浸润可导致黑素细胞的损害［6］。MSC是一类多潜能干细胞。研究表明,MSC可抑制丝裂原和抗原提呈细胞诱导的T细胞活化及淋巴细胞的增殖反应,并能调节淋巴细胞部分细胞因子的分泌［7-8］。人真皮来源的间充质干细胞可抑制皮肤归巢CD8+T淋巴细胞的增殖,并诱导其凋亡,抑制CD8+T淋巴细胞产生细胞因子和趋化因子［9］。

IL-13为重要的Th2型细胞因子,于1993年第一次描述,在活化的人类T淋巴细胞的分子克隆中被识别［8］。其生物学功能主要包括参与IgE合成,在气道的结构和炎症细胞中起重要作用等。在本研究中,我们比较了白癜风患者皮损周围及外周血CD8+T淋巴细胞表达IL-13的差异,发现患者皮损周围CD8+T细胞分泌IL-13更为显著。IL-13对T细胞的活化没有直接的影响,但是可通过多种途径影响Th2型反应,如诱导Th2型细胞募集的趋化因子的表达。本研究中,我们发现患者皮损周围CD8+T淋巴细胞较外周血CD8+T淋巴细胞比较,分泌IL-13更显著,提示IL-13和CD8+T淋巴细胞的活性可能相关。DMSC具有免疫抑制功能,以往研究［10］提示,不同来源的MSC可以抑制T细胞的活化、增殖以及迁移,进而抑制T细胞的免疫反应。我们将DMSC和患者CD8+T淋巴细胞共同培养后,发现CD8+T淋巴细胞分泌细胞因子IL-13水平明显下降,由此推测DMSC抑制CD8+T淋巴细胞的活化、增殖或迁移,从而使CD8+T淋巴细胞分泌的细胞因子减少,包括IL-13。我们将不同浓度的rIL-13加入黑素细胞培养基中,观察其对黑素细胞增殖的影响,结果发现培养72 h后,不同浓度rIL-13对黑素细胞的增殖无明显影响,推测IL-13与黑素细胞的增殖无明显相关,可能是CD8+T淋巴细胞的活性标志之一,有关IL-13的具体作用机制尚待进一步研究。

综上所述,本研究提示白癜风患者皮损周围CD8+T淋巴细胞分泌IL-13,而DMSC能够免疫抑制CD8+T细胞的功能和活性,抑制CD8+T细胞分泌IL-13,IL-13可能与白癜风皮损周围的微环境和CD8+T淋巴细胞的毒性和活性相关。

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2013-02-07)

(本文编辑:尚淑贤)

Effect of human dermal mesenchymal stem cells on the expression and secretion of interleukin-13 by perilesional CD8+T lymphocytes from patients with vitiligo

Bao Huaye，Zhou Miaoni，Xu Aie.Hangzhou Clinical College Affiliated to Anhui Medical University，Department of Dermatology，Third People's Hospital of Hangzhou，Hangzhou 310009，China

Xu Aie，Email：xuaiehz@msn.com

ObjectiveTo evaluate the effect of human dermal mesenchymal stem cells(DMSCs)on the expression and secretion of interleukin(IL)-13 by perilesional CD8+T lymphocytes from patients with vitiligo.MethodsTissue specimens were obtained from the perilesional region of six patients with active vitiligo，and CD8+T lymphocytes were isolated from both the tissue specimens and peripheral blood of these patients.DMSCs and melanocytes were obtained from the foreskin tissue of healthy males.The 3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，inner salt(MTS)assay was performed to estimate the effect of different concentrations of recombinant IL-13 on the proliferation of melanocytes，reverse transcripition-PCR and Western blotting to detect the mRNA and protein expressions of IL-13 in perilesional and peripheral blood CD8+T lymphocytes respectively，real-time quantitative reverse transcription (RT)-PCR and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)to detect the IL-13 mRNA expression in，and IL-13 protein expression in the culture supernatant of，CD8+T lymphocytes before and after coculture with DMSCs，respectively.Statistical analysis was done byttest.ResultsNo obvious changes were observed in the proliferation of melanocytes treated with different concentrations(10，50，100，250，500 μg/L)of recombinant IL-13 for various durations(24，48，72 and 96 hours)compared with untreated melanocytes(allP＞0.05).Both perilesional and peripheral blood CD8+T lymphocytes expressed IL-13，and the expression was stronger in perilesional than in peripheral blood CD8+T lymphocytes.A significant decrease was noted in IL-13 mRNA expression(0.100 0±0.002 4 vs.0.383 2±0.018 7，P＜0.05)and protein level in the culture supernatant((1 509.62±48.44)ng/L vs.(5 507.98±34.11)ng/L，P＜0.05)of CD8+T lymphocytes cocultured with DMSCs compared with monocultured CD8+T lymphocytes.ConclusionsThere is a strong expression of IL-13 by perilesional CD8+T lymphocytes in patients with vitiligo，which may be inhibited by DMSCs and serve as a target for the treatment of vitiligo.

Vitiligo；CD8-positive T-lymphocytes；Mesenchymal stem cells；Interleukin-13

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.01.007

国家自然科学基金(81071294,81271758);浙江省自然科学基金(Z2100973)

310009杭州,安徽医科大学附属杭州临床学院,杭州市第三人民医院皮肤科

许爱娥,Email:xuaiehz@msn.com