特应性皮炎患者外周血皮肤归巢的CD8+T细胞研究

张宝祥 林茂 段志武 张佃财

特应性皮炎患者外周血皮肤归巢的CD8+T细胞研究

张宝祥 林茂 段志武 张佃财

目的探讨特应性皮炎(AD)患者外周血CD8+T细胞皮肤归巢及杀伤功能相关蛋白的表达。方法15例AD患者和14例健康人,用流式细胞仪,检测外周血CD8+T细胞、表达皮肤淋巴细胞相关抗原的CD8+T细胞(CLA+CD8+T细胞)的比例。结果CD8+T细胞比例在AD组和对照组之间差异无统计学意义(P＞0.05);CD8+T细胞穿孔素、颗粒酶B和FasL的表达在两组间差异亦无统计学意义(均P ＞0.05)。CLA+CD8+T细胞比例在AD组(3.80%±1.46%)高于健康对照组(2.18%±0.85%)(t=3.636,P＜0.01),AD组CLA+CD8+T细胞比例与SCORAD(SCORing of Atopic Dermatitis)评分呈正相关(r=0.565,P＜0.05);CCR4在CD8+T细胞表达在AD组(13.86%±4.42%)高于健康对照组(9.50%±2.14%)(t =3.738,P＜0.01),而CCR10和CXCR6的表达在两组间差异均无统计学意义(P＞0.05)。CLA+CD8+T细胞穿孔素的表达在AD组(74.27%±15.94%)高于健康对照组(57.20%±14.64%)(t=2.998,P＜0.01),颗粒酶B的表达在AD组(70.90%±13.85%)也高于健康对照组(56.41%±11.00%)(t=3.104,P＜0.01),而FasL的表达在两组间差异无统计学意义(P＞0.05)。CLA+CD8+T细胞CCR4、CCR10和CXCR6的表达在AD组与对照组间差异无统计学意义(均P＞0.05)。结论AD患者外周血CLA+CD8+T细胞数量增加,杀伤功能相关蛋白穿孔素、颗粒酶B的表达增强,可能参与了AD的发病。

皮炎,特应性;CD8阳性T淋巴细胞;皮肤淋巴细胞相关抗原;颗粒酶类;受体,趋化因子

特应性皮炎(AD)是一种常见的慢性复发性、瘙痒性、炎症性皮肤病。近来,CD8+T细胞在AD发病机制中的作用受到重视,而皮肤淋巴细胞相关抗原(cutaneous lymphocyte-associated antigen，CLA)可介导T细胞从外周血向皮肤归巢［1］。细胞毒性T细胞杀伤靶细胞需要通过穿孔素、颗粒酶B、FasL的介导［2］,而AD患者外周血CLA+CD8+T细胞杀伤功能相关蛋白的表达是否存在异常未见报道。本文拟通过检测AD患者外周血CD8+T细胞皮肤归巢及杀伤功能相关蛋白表达,探讨其在AD发病机制中的作用。

对象与方法

1.对象:2012年5月至2013年1月潍坊市益都中心医院皮肤科门诊15例AD患者,男8例,女7例,年龄(17±6)岁,所有患者符合Hanifin-Rajka诊断标准［3］;治疗前6个月内未系统应用糖皮质激素及免疫抑制剂,治疗前4周内未应用抗组胺药及外用糖皮质激素。排除标准:血常规、尿常规、血糖、抗核抗体、C反应蛋白等检查有异常者,伴有如自身免疫性甲状腺疾病、Ⅰ型糖尿病、斑秃、慢性荨麻疹、过敏性哮喘等免疫相关性疾病者。根据SCORAD评分标准判定病情严重程度,15例AD患者的 SCORAD评分为 36.32±24.13［4］。选取 14例健康志愿者作为对照,男7例,女7例,年龄(20±7)岁,AD组和对照组之间年龄及性别构成差异无统计学意义(P＞0.05)。本研究经过医院伦理委员会批准,所有入选者均签署知情同意书。

2.方法:

(1)试剂及仪器:单克隆荧光抗体抗CD3-别藻蓝蛋白(APC)、抗CD8-叶绿素蛋白(PerCP)、抗CLA-异硫氰酸荧光素(FITC)、抗穿孔素-藻红蛋白(PE)、抗颗粒酶B-PE、抗FasL-PE、抗C-C趋化因子受体4(CCR4)-PE、抗 CCR10-PE、抗C-X-C趋化因子受体6(CXCR6)-PE,同型对照抗体鼠抗人IgG1-PE和IgG2a-FITC,以及破膜剂(IntraSure Kit)和流式细胞仪(FACSCalibur)均源自美国BD公司。

(2)实验步骤:抽外周静脉血3 ml,用肝素抗凝。取400 μl全血,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3遍,适量PBS重悬;每个试管中均加入50 μl混悬液,再加入抗CD3-APC和抗CD8-PerCP各6 μl,检测各蛋白在CLA+CD8+T细胞表达时再加入抗CLAFITC 6 μl。然后将试管分为两组:第1组进行细胞膜表面蛋白检测,即向各试管分别继续加入抗FasL-PE、抗CCR4-PE、抗 CCR10-PE或抗CXCR6-PE各6 μl,充分混匀避光孵育15 min,加入溶血素1 ml避光孵育10 min,离心去上清,300 μl PBS重悬,立即用流式细胞仪检测;第2组进行细胞质内蛋白检测:先将试管避光孵育15 min,再加入破膜剂A液100 μl避光孵育5 min,加溶血素2 ml并孵育10 min,离心去上清,PBS洗1遍,加破膜剂B液50 μl,分别加入抗穿孔素-PE、抗颗粒酶B-PE各6 μl, 避光孵育 15 min;PBS 洗 1 遍;300 μl PBS 重悬,立即用流式细胞仪检测。两组均设同型对照。

3.统计学分析:用SPSS13.0统计软件进行统计处理,P＜0.05为差异有统计学意义。两组资料间比较用t检验,相关性用Pearson相关分析。

结 果

1.AD患者外周血CD8+T细胞的比例及其杀伤功能相关蛋白的表达:外周血CD8+T细胞的比例在AD组(38.67%±7.23%)和对照组(35.14%±6.10%)之间比较,差异无统计学意义(P＞0.05,图1);AD组和对照组之间穿孔素(52.41%±15.65%比50.10% ±14.85%)、颗粒酶B(44.50% ±15.76%比39.39%±13.21%)和FasL(7.37%±3.77%比6.74%±2.65%)表达率相比,差异均无统计学意义(均P＞0.05)。

2.外周血CD8+T细胞皮肤归巢及归巢相关蛋白的表达:外周血CLA+CD8+T细胞的比例在AD组(3.80%±1.46%)高于对照组(2.18%±0.85%),t=3.636,P＜0.01(图1)。同时对CD8+T细胞表达归巢相关蛋白检测发现,CD8+T细胞CCR4表达在AD组(13.86%±4.42%)高于对照组(9.50%±2.14%),t=3.738,P=0.01,而AD组和对照组之间CD8+T细胞CCR10(36.19%±12.51%比38.52%±10.52%)和CXCR6(8.52%±3.82%比9.65%±3.45%)的表达率相比,差异均无统计学意义,均P＞0.05。

AD患者外周血增高的CLA+CD8+T细胞的比例及CCR4在CD8+T细胞的表达率与SCORAD评分的相关性,结果显示CLA+CD8+T细胞的比例与SCORAD正相关(r =0.565,P＜0.05),而CCR4在CD8+T细胞的表达率与SCORAD评分之间无相关性(r=0.154,P＞0.05)。

图1 流式细胞仪检测外周血CD8+T细胞(a1,b1)、CLA+CD8+T细胞(a2,b2)的比例 a1,a2:特应性皮炎患者;b1,b2:健康人

3.AD患者外周血CLA+CD8+T细胞杀伤功能相关蛋白的表达:对外周血CLA+CD8+T细胞表达杀伤功能相关蛋白检测发现,穿孔素的表达在AD组(74.27%±15.94%)高于对照组(57.20%±14.64%),t=2.998,P＜0.01;同时,颗粒酶B的表达在AD组(70.90%±13.85%)也高于对照组(56.41%±11.00%),t =3.104,P＜0.01;但FasL的表达在两组间(9.18%±4.32%比8.16%±3.94%)比较差异无统计学意义,P＞0.05)。

4.AD患者外周血CLA+CD8+T细胞皮肤归巢相关蛋白的表达:对外周血CLA+CD8+T细胞表达归巢相关蛋白检测发现,在AD组和对照组之间CLA+CD8+T细胞CCR4(86.82%±8.86%比83.34%±6.15%)、CCR10(55.28% ±9.08%比53.36% ±7.35%)和CXCR6(1.16%±0.22%比0.92%±0.25%)的表达率差异均无统计学意义(均P＞0.05)。

讨 论

近年来研究发现CLA+CD8+T细胞与一些免疫相关性及炎症性皮肤病的发病有关。Akdis等［5］发现在AD患者外周血CD45RO+CLA+CD8+T细胞处于激活状态,且在皮损中CLA+CD8+T细胞高表达。本研究发现AD患者外周血CLA+CD8+T细胞比例增高,并且与SCORAD评分正相关,提示CLA+CD8+T细胞在AD发病中起作用。AD患者外周血CLA+CD8+T细胞比例增加的机制,可能与CLA+T细胞在皮肤周围淋巴结与皮损部位之间的再循环有关,在周围淋巴结处T细胞在抗原刺激下增殖分化为CLA+T细胞,该细胞进入皮肤炎症部位后被再次激活并进一步上调CLA的表达水平;这些被再次激活的CLA+T细胞重新进入周围淋巴结,在抗原刺激下再次增殖分化;此再循环过程对于外周血和皮肤CLA+T细胞的活性及高水平表达十分重要［6］。

CD8+T细胞识别和杀伤靶细胞可以通过两种途径实现:一是穿孔素破坏靶细胞膜结构,然后颗粒酶B等进入细胞质,从而激活胞质中的蛋白酶,使细胞发生凋亡;二是通过FasL识别靶细胞表面的Fas,通过Fas触发靶细胞内部的凋亡程序,使靶细胞发生程序性细胞死亡［2］。Yawalkar等［7］研究发现,AD 患者皮损处CD8+T细胞穿孔素、颗粒酶B的表达比正常皮肤明显增加。另有报道AD患者角质形成细胞表达FasL水平上调,外周血CLA+CD45RO+T细胞通过Fas-FasL途径激活诱导的细胞死亡［8］。本研究发现穿孔素、颗粒酶B在AD患者外周血CLA+CD8+T细胞的表达升高,提示CLA+CD8+T细胞可能通过穿孔素/颗粒酶B介导的杀伤途径发挥作用。

T细胞表面的趋化因子受体与内皮细胞上的趋化因子结合,在CLA介导的T细胞皮肤归巢过程中起调节作用,其中包括CCR4、CCR10和CXCR6。研究发现银屑病患者外周血CCR4在CD8+T细胞的表达率高于健康人［9］。CCR10在CLA+T细胞向皮肤炎症部位归巢中起重要调节作用［10］。CXCR6+CD8+T细胞的数量在银屑病患者外周血及皮损中均增高［11］。本研究发现,CCR4在CD8+T细胞的表达在AD患者高于健康人,但CCR10和CXCR6的表达在两组间却没有差异,说明CCR4而非CCR10和CXCR6可能在CD8+T细胞相关的AD发病机制中起作用。CCR4、CCR10和CXCR6在CLA+CD8+T细胞的表达在两组间比较均无明显差异,但是与CD8+T细胞的表达率较低不同,CCR4、CCR10在两组间的表达率均较高,而CXCR6的表达却降低,提示趋化因子受体在协同CLA+CD8+T细胞皮肤归巢中作用机制不同。

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［3］顾恒，邵长庚.异位性皮炎的诊断［J］.临床皮肤科杂志，2000，29(2)：123-125.

［4］Severity scoring of atopic dermatitis：the SCORAD index.Consensus Report of the European Task Force on Atopic Dermatitis［J］.Dermatology，1993，186(1)：23-31.

［5］Akdis M，Simon HU，Weigl L，et al.Skin homing(cutaneous lymphocyte-associated antigen-positive)CD8+T cells respond to superantigen and contribute to eosinophilia and IgE production in atopic dermatitis［J］.J Immunol，1999，163(1)：466-475.

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2013-02-16)

(本文编辑:尚淑贤)

Peripheral blood skin-homing CD8+T cells in patients with atopic dermatitis

Zhang Baoxiang*，Lin Mao，Duan Zhiwu，Zhang Diancai.*Department of Dermatology，Yidu Central Hospital of Weifang City，Weifang 262500，Shandong，China

Lin Mao，Email：lmsleeper1981@gmail.com

ObjectiveTo quantify the percentage of CD8+T cells and their expressions of cytotoxic molecules and homing-related chemokine receptors in peripheral blood from patients with atopic dermatitis(AD).MethodsPeripheral blood was obtained from 15 patients with AD and 14 healthy controls.Flow cytometric analysis was performed to determine the percentages of CD8+T cells and CD8+CLA+T cells in the peripheral blood samples，as well as the expression levels of cytotoxic molecules and homing-related chemokine receptors on these cells.Differences in these parameters were analyzed usingttest，and relationship between these parameters was evaluated using Pearson correlation coefficient.ResultsNo significant difference was observed between the patients with AD and healthy controls in the percentage of CD8+T cells，the expressions of perforin，granzyme B，CCR10，CCR6 or FasL on CD8+T cells，or the expressions of CCR4，CCR10，CXCR6 or FasL on CLA+CD8+T cells(allP ＞0.05).A significant increase was noted in the percentage of CLA+CD8+T cells(3.80%±1.46%vs.2.18%±0.85%，t=3.636，P＜0.01)and expression rates of CCR4 on CD8+T cells(13.86% ±4.42%vs.9.50% ±2.14%，t=3.738，P＜0.01)as well as perforin and granzyme B on CLA+CD8+T cells(74.27% ±15.94%vs.57.20% ±14.64%，t=2.998，P＜0.01；70.90% ±13.85%vs.56.41% ±11.00%，t=3.104，P＜0.01)in the patients with AD compared with the healthy controls.ConclusionsThe proportion of CLA+CD8+T cells is increased with enhanced expressions of cytotoxic molecules such as perforin and granzyme B in peripheral blood of patients with AD，which may contribute to the pathogenesis of AD.

Dermatitis，atopic；CD8-positive T-lymphocytes；Cutaneous lymphocyte-associated antigen；Grazymes；Receptors，chemokine

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.01.006

262500山东省潍坊市益都中心医院皮肤性病科(张宝祥、段志武、张佃财);大连医科大学附属第二医院皮肤性病科(林茂)

林茂,Email:lmsleeper1981@gmail.com