中药清毒栓对宫颈癌Hela细胞的抑制作用

王艳萍 钱 鑫 田 林 金 哲 (北京中医药大学，北京 0009)

宫颈癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，而且近年来有年轻化的趋势〔1〕。宫颈癌的发生和患者杂乱、过早、过多的性生活以及缺乏良好的卫生习惯有关，但感染人类乳头状瘤病毒(HPV)是导致宫颈癌的最主要原因，目前部分学者认为感染疱疹病毒型也能引起宫颈癌，但是该观点没有确定〔2，3〕。西医治疗主要是手术、放疗、化疗及新辅助化疗的方法〔4〕，易造成机体免疫功能下降，甚至出现并发症而导致死亡。现代医学认为辨证治疗宫颈癌，通过整体观念，把人体有机地结合起来，调整人体的抗病能力，是治疗肿瘤的重要环节。本文旨在研究中药制剂清毒栓对Hela细胞的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人宫颈癌Hela细胞购自中国科学院上海生命科学院。

1.1.2 药物 中药清毒栓由北京中医药大学东方医院金哲教授惠赠;保妇康栓海南碧凯药业有限公司。批号:Z4602258

1.1.3 主要试剂与仪器 DMEM全培养液购自赛默飞世尔生物化学制品有限公司;胎牛血清购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，胰酶及乙二胺四乙酸(EDTA):购于 SERVA公司及赛多利斯公司;CCK-8试剂盒，线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)均由(碧云天生物技术研究所);荧光显微镜 NiKon ECLIPSE，二氧化碳培养箱，均由(日本三样电机株式会社制造);AN YANG超净台(苏州安洋科技发展有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 中药清毒栓及保妇康栓提纯 将两种中药分别溶于10 ml水中，将溶液倒入分液漏斗中，分别加入三氯甲烷10 ml，溶液分为两层，上层为水和蜡质层，下层为氯仿和中药的有效成分层，将下层置入约80℃水浴箱中蒸发，剩余物质为中药有效成分，放入4℃中保存待用。

1.2.2 CCK-8法检测中药清毒栓对Hela细胞增殖的影响 取对数生长期的 Hela细胞，加入 0.25%胰酶消化，离心1 500 r/min 5 min，细胞计数，调整细胞悬液为 1×104/ml，接种于96孔板(100 μl/孔)，将培养板置入5%CO2培养箱孵育，细胞贴壁后，每孔分别加入 0.022 g/ml，0.011 g/ml，0.005 5 g/ml浓度的中药清毒栓;保妇康栓浓度为0.035 g/ml，各加入15 μl/孔，设5个复孔，终体积为200 μl，随机分为空白对照组，清毒栓高、中、低剂量组及保妇康栓组，置入5%CO2培养箱孵育，观察在24 h时中药清毒栓及保妇康栓对宫颈癌Hela细胞的作用。在实验各时间点加入20 μl CCK-8试剂，混匀。在酶标仪上测定各孔吸光值(OD)〔5〕，波长492 nm，记录结果。

1.2.3 线粒体膜电位法检测中药清毒栓对Hela细胞凋亡的作用 取对数生长期的 Hela细胞，加入0.25%胰酶消化，离心1 500 r/min，5 min。细胞计数，接种于六孔板(4.5×105/孔)，待细胞贴壁，随机分为空白对照组，清毒栓高、中、低剂量组及保妇康栓组，每孔加入不同浓度的清毒栓;浓度同1.2.2中，加入250 μl/孔，终体积为2 ml，设2个复孔，置入5%CO2培养箱孵育24 h。用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞1次，加入1 ml细胞培养液。同时加入1 ml线粒体膜电位检测试剂(JC-1)染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育20 min。在孵育期间，将配置好的JC-1染色缓冲液(1X)放置于冰浴。37℃孵育结束后，吸除上清，用JC-1染色缓冲液(1X)洗涤2次。加入2 ml细胞培养液。荧光显微镜下观察，激发波长为490 nm，发射波长530 nm，拍照。每个视野计数100个细胞中所含的程序性死亡细胞数，取其均数计算细胞程序性死亡率。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计学分析软件对数据进行统计分析。计量资料以s表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 CCK-8法检测中药清毒栓对Hela细胞增殖作用的影响不同浓度的清毒栓对宫颈癌Hela细胞具有一定的抑制作用，并在24 h时作用最为明显。清毒栓高剂量组(0.920±0.055)与保妇康栓组(0.737±0.038)、空白对照组(1.387±0.036)及清毒栓中、低剂量组(1.249±0.065)、(1.307±0.034)比较具有显著性差异(P＜0.05)。见图1。

2.2 线粒体膜电位法检测中药清毒栓对Hela细胞凋亡的作用 不同浓度的清毒栓对宫颈癌Hela细胞膜电位引起不同程度的下降，在24 h时作用最为明显。保妇康栓组〔(56.16±0.096)%〕与空白组〔(22.52±0.062)%〕比较差异有统计学意义(P＜0.05)。Hela活细胞数量明显减少，清毒栓高剂量组〔(55.74±0.096)%〕与 清 毒 栓 中、低 剂 量 组 〔(37.90±0.069)%、(34.74±0.078)%〕比较具有显著性差异(P＜0.05)。荧光显微镜下可见，正常对照组细胞状态良好，呈橘红色荧光，胞浆着色深，可见少量凋亡细胞，高剂量清毒栓组可见许多绿色荧光，少许橘红色荧光。见图2。

图1 各组宫颈癌Hela细胞镜下一次性给药(×20)

图2 各组Hela细胞线粒体膜电位镜下一次性给药(×20)

3 讨论

研究表明，肿瘤的发生与细胞增殖、细胞凋亡有着密切的关系，细胞凋亡在维持多细胞生物机体稳态、生长发育等生命活动中发挥重要作用〔6〕。

清毒栓为多年临床用药，主要成分为莪术、紫草、黄柏等，治疗以辨病为主，抓住“毒邪结聚”这一病机关键，治法以攻毒散结，选用莪术破瘀消癥，其中莪术主要活性成分为B-榄香烯和莪术醇。其抗肿瘤的主要机制通过直接细胞毒作用，诱导肿瘤细胞发生凋亡〔7〕。紫草以凉血解读，活血散瘀，作为传统中药，其化学成分复杂，具有广泛的药理作用，抗肿瘤作用是其中之一。紫草提取物能抑制多种肿瘤细胞生长增殖，导致肿瘤细胞凋亡〔8〕。黄柏清热燥湿，解读消肿;黄柏具有抗病毒，提高免疫功能的功效。

本实验采用CCK-8检测法，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性橙黄色的甲臜产物。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在492 nm波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。CCK-8检测法是一种综合指标较好的细胞活性检测试剂，利用CCK-8试剂检测细胞活性的方法〔9〕，增加实验的可信度。结果表明中药清毒栓可明显抑制宫颈癌Hela细胞增殖，其中以高剂量抑制细胞增殖的作用比较明显。

本研究采用线粒体膜电位检测法，线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降，同时也可以用JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。结果显示，在荧光显微镜下可现明显的荧光反应，Hela细胞经JC-1染色后仅呈现橘红色荧光，若出现早期凋亡的Hela细胞会发出绿色荧光。线粒体膜电位测定结果表明中药清毒可能通过降低线粒体膜电位抑制肿瘤细胞的增殖和促进其凋亡从而发挥其抗肿瘤作用。本研究结果为中药清毒栓对宫颈癌的防治提供了一定的实验基础，为更深步的探讨抗肿瘤机制提供了新的理论依据。

1 单玉珍，马向东，王 建.人乳头瘤病毒与宫颈癌研究进展〔J〕.中国临床研究，2012;25(4):313-5，318.

2 李震乾，林爱珍，崔金环，等.HPV-DNA检测与 TCT检查在宫颈癌前病变筛查中的相关性〔J〕.现代医院，2010;10(1):28-30.

3 Sandri MT，Lentati P，Benini E，et al.Compari-son of the Digene HC2 assay and the Roche AMPLICOR human papillsmariras(HPV)test for detection of hig-risk HPV genotypes in cervical samples〔J〕.J Clin Microbiol，2006;44(16):2141-6.

4 王绍光.妇科恶性肿瘤动脉化疗的种类、途径和方式〔J〕.实用妇产科杂志，2006;22(8):453-5.

5 张雪宝，陆天才，张 超.宫颈原位癌中Ki-67的表达及其与细胞凋亡的关系〔J〕.诊断病理学杂志，2004;11(6):418-21.

6 高 超，华子春.细胞凋亡检测方法新进展〔J〕.中国细胞生物学学报，2011;33(5):564-9.

7 宋利琼，张昌菊.莪术油联合干扰素对小鼠宫颈癌端粒酶活性和细胞凋亡的影响〔J〕.上海中医药杂志，2006;40(7):68-9.

8 杨 宏，伊淑莹，翟 静.紫草提取物抗肿瘤的作用机制〔J〕.生命的化学，2013;33(2):49-53.

9 熊建文，肖 化，张镇西.MTT法和CCK-8法检测细胞活性之测试条件比较〔J〕.激光生物学报，2007;16(5):559-62.