ERCC1单核苷酸多态性与老年非小细胞肺癌放疗疗效的相关性

周 宪 (重庆医科大学附属第一医院肿瘤科，重庆 400030)

非小细胞肺癌(NSCLC)老年患者因发现时多数已是晚期〔1〕，已失去手术机会，因此放化疗成为其主要治疗手段。而一般认为肿瘤细胞DNA损伤修复能力与辐射敏感性密切相关。本文采用限制性长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术研究ERCC1 rs3212986 SNP与NSCLC老年患者放疗疗效的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2010年1月至2013年1月老年NSCLC患者采用三维适形放疗或常规放疗44例，男32例，女12例，年龄65～83岁，平均(71.2±4.3)岁;均为初次治疗。卡氏评分≥80分32例，70～80分12例，病理类型:腺癌10例，鳞癌27例，腺鳞癌2例;未能分类2例，分化差的癌3例;T分期T1 3例，T2 18例，T3 10例，T4 13例;N分期:N1 2例，N2 22例，N3 20例。UICC分期:Ⅲa 19例，Ⅲb 25例;放疗方案:三维适形26例;常规放疗18例。

1.2 入组标准 经细胞学或病理证实为NSCLC的患者;全部为住院治疗患者;卡氏评分＞70分;2002年UICCTNM分期为Ⅲ期;年龄60岁以上;无明显心、肺、肝、肾功能异常;预计生存期3个月。患者签署知情同意书后入组。

1.3 治疗方法 常规分割治疗18例，三维适形放疗26例。常规放疗患者仰卧于模拟机床，平静呼吸，透视下所见肿瘤边缘外放1～2 cm作为靶区，照射范围包括原发病灶、同侧纵隔和肺门，病灶位于上叶则照射野上界达隆突下3～5 cm，病灶位于下叶则下界达膈面。前后对穿野照射总量40 Gy后避开脊髓角度野照射，若锁骨上出现淋巴结转移则加照锁骨上野。照射剂量为1.90～1.95 Gy/次，5次/w，总剂量为66～70 Gy，6～7 w完成。三维适形放疗患者仰卧于三维立体定位框架床，双臂上抬抱头，真空负压袋和热塑体膜固定，平静呼吸状态下行胸部CT模拟定位和CT扫描，扫面范围从胸廓入口至肋膈角水平，扫描层厚为0.5 cm，全部病例均做增强扫描。将CT影像资料转到三维治疗计划系统。根据ICRU50号文件标准定义规定勾画放疗靶区，由放射诊断和放射治疗科医师共同勾画大体肿瘤体积(GTV)，包括原发灶及转移淋巴结，放射靶区(CTV)的边界为CT肺窗条件下GTV外1 cm(不包括预防照射淋巴结引流区)，CTV外放5 mm为计划靶体积(PTV)。利用射野方向观(BEV)进行照射野设计，以PTV中心为射野等中心，通过剂量体积直方图(DVH)进行治疗计划优化，一般采用4～6个共面射线束，靶区剂量采用90%的等剂量曲线肿瘤剂量为200 Gy/次，5次/w的常规分割，总剂量66 Gy。同时保证肺V20≤25%，脊髓≤40 Gy，食管≤50 Gy。

1.4 疗效观察及毒性评定 治疗1～3个月，近期疗效按WHO制定的实体瘤近期疗效评定标准评价，分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、无变化(NC)和进展(PD)。放疗毒副作用按照美国肿瘤放射治疗协作组(RTOG)分级标准分为0～4级。

1.5 人切除修复交叉互补基因(ERCC1)分析 取患者抗凝外周血样本100 μl，用磁珠法提取DNA。操作流程参照MzgaZorb DNA微量提取试剂盒(BioFlux公司产品)说明书进行。PCRRFLP基因分型引物采用PIRA-PCR在线工具及primer premier软件设计。正义:5'-CCGGAGGCTGTTTGATGT，反义:CAGTGCCCCAAGAGGAGAT，PCR 产物 332 bp，酶切产物 CC:332 bp，AA:239/93 bp，CA:332/239/93 bp。见表2。PCR条件为95℃预变性 2 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35 个循环后72℃延伸10 min。酶切反应为15 μl体系，包括12 μl PCR产物，1×酶切反应缓冲液和3 U MboⅡ内切酶。37℃水浴3 h，3%琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析系统分析，判断基因型。

1.6 统计学方法 应用SPSS13.0软件进行χ2检验，kaplanmeier生存分析及logrank分析。

2 结果

2.1 ERCC1 rs3212986多态位点与放疗敏感性分析 ERCC1 rs3212986多态位点CC、CA和AA三种基因型中，放疗敏感性(CR和PR)和不敏感(NC和PD)患者的分布比分别是6例(30%)和14例(70%)、7例(36.8%)和 12例(63.2%)、3例(60%)和2例(40%)，显著改善放疗患者疗效的AA基因型。与CC基因型患者比较，CA和AA基因型患者对放疗更敏感，近期疗效更好。携带CA基因型患者和携带AA基因型患者放疗更加敏感，OR值分别达到1.31(95%CI=0.59～2.62，P=0.542)和5.63(95%CI=1.01-20.37，P=0.028)。研究发现，随着A等位基因数量的增加，患者放疗的疗效逐渐变好，放疗敏感性逐渐增加，患者对放射治疗敏感程度的增加与其携带A等位基因数目的增加保持一致。携带AA基因型患者是三种基因型中放疗最敏感、近期疗效最好的患者，敏感程度是不携带A等位基因(CC基因型)患者的2.46倍，差异有统计学意义(P=0.041)。而携带一个A等位基因的患者其放疗敏感性是不携带A等位基因患者的1.46倍(95%CI=0.81～2.57，P=0.185)。此外，常规放疗与适形放疗患者不同基因型之间的疗效比较差异无统计学意义(P=0.502、0.495)。

2.2 各临床因素和NSCLC放疗结局的危险度评价 性别、年龄、病理、治疗方法等因素对治疗结局无明显影响(均P＞0.05);基因型、分期对治疗结局有明显影响(P＜0.05)。患者ERCC1 rs3212986 SNP对放疗毒副作用无明显影响(P＞0.05)。见表1。

表1 各临床因素和NSCLC放疗结局的危险度评价

3 讨论

临床上观察到同样的病例给予同样的放疗方案，患者的放疗反应和最终疗效也有一定的差异。若能找到能预测放疗敏感性的生物标志物，就可能设计出个体化的放疗方案，提高疗效并减少不必要的放疗反应。

研究表明，电离辐射可造成DNA结构和功能损伤，而DNA损伤修复过程中许多基因起着不同的重要作用，这些基因的SNPs可改变蛋白质表达水平或功能，进而改变DNA修复能力，这为检测此类基因的SNPs来预测放疗敏感性提供了思路。

近年来随着肿瘤分子生物学的发展，已发现ERCC1的表达水平和放疗疗效及预后密切相关。回顾迄今国内外针对耐药基因与放疗进行的许多研究及临床试验发现，ERCC1过表达者易获得较差疗效，而ERCC1的表达往往与其SNP相关〔1〕。

ERCC1基因编码的蛋白在核苷酸切除修复中发挥重要作用，同时，也参与了如紫外线或者顺铂类亲电子复合物所造成的DNA损伤修复过程〔1〕。ERCC1可催化DNA重组修复和链间交联修复。ERCC1蛋白突变或者表达量的变化都有可能影响细胞DNA损伤修复能力。

近年来的研究表明，ERCC1 rs3212986位点SNP与直肠癌患者接受新辅助放化疗疗效相关，并且该位点携带不同基因型的患者ERCC1蛋白表达水平不相同。ERCC1蛋白的表达水平与接受铂类药物治疗患者的药物抵制及放疗疗效相关联〔2〕。研究分析了术后放疗的NSCLC患者ERCC1 SNP与正常组织放疗敏感性相关，发现ERCC1 rs3212986位点SNP与放疗导致毛细血管扩张症和皮下纤维化的发生密切相关〔3〕。

研究分析发现ERCC1 SNP或低表达患者中使用个体化治疗获得更高的有效率，但并未发现能延长疾病无进展生存期及总生存期〔4〕。

目前研究主要集中于DNA修复基因SNP位点与肿瘤易感性的相关，而其预测癌症疗效的研究才刚刚起步〔5〕。本研究结果发现，上述SNP差异与放疗疗效相关，该位点不同基因型NSCLC老年患者放疗的近期疗效不同。携带CA基因型患者和携带AA基因型患者放疗更加敏感，随着A等位基因数量的增加，患者放疗的疗效逐渐变好。原因可能是该位点SNP的变化导致ERCC1表达量出现变化，进而影响DNA损伤后修复功能。

1 Sakano S，Ogawa S，Yamamoto Y，et al.ERCC1 and XRCC1 expression predicts survival in bladder cancer patients receiving combined trimodality therapy〔J〕.Mol Clin Oncol，2013;1(3):403-10.

2 Páez D，Salazar J，Paré L，et al.Pharmacogenetic study in rectal cancer patients treated with preoperative chemradiotherapy:polymorphisms in thymidylate synthase，epidermal growth factor receptor，GSTP1，and DNA repair genes〔J〕.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2011;81(5):1319-27.

3 Gandara DR，Grimminger P，Mack PC，et al.Association of epidermal growth factor receptor activating mutations with low ERCC1 gene expression in non-small cell lung cancer〔J〕.J Thorac Oncol，2010;5(12):1933-8.

4 Mountzios G，Vitae，Dimopoulos MA，et al.Histopathologic and genetic alterations as predictors of response to treatment and survival in lung cancer:a review of published data〔J〕.Crit Rev Oncol Hematol，2010;75(2):94-109.

5 Roth JA，Carlson JJ.Prognostic role of ERCC1 in advanced non-smallcell lung cancer:a systematic review and meta-Analysis〔J〕.Clin Lung Cancer，2011;12(6):393-401.