FISH联合流式免疫分型在急性白血病诊断中的应用

彭淑莹，伍腊妍 (.肇庆医学高等专科学校医技药学系检验教研室，广东 肇庆 56000;:广东省肇庆市第一人民医院检验科，广东 肇庆 56000)

急性白血病(AL)是造血干细胞的恶性克隆性疾病，病程短，死亡率高，严重威胁着人类的生命和健康。现代治疗之后有不少患者病情获得缓解以至于长期存活，但传统的细胞形态学和组织化学法检查已经无法满足现在临床治疗的要求［1］。随着流式细胞仪和FISH技术的发明，其在血液病诊断和治疗中的应用越来越广泛。查阅文献发现，应用FISH技术联合流式细胞仪免疫分型可以在细胞形态学和组织化学检查的基础上将急性白血病诊断率提高到90% ～99%，且对临床个体化治疗和判断预后具有重要的指导意义。我校检验教研室联合人民医院分别应用上述两种方法对来诊的76例急性白血病患者进行初诊，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料:选取2011年7月～2013年7月到人民医院血液科就诊的76例急性白血病患者为研究对象，男女比例为2∶1，平均年龄39.3岁。经过最终确诊，急性髓细胞白血病(AML)54例，急性淋巴细胞白血病(ALL)22例。

1.2 骨髓细胞形态学检查方法:按照常规骨髓穿刺、涂片和染色，细胞化学检查，油镜下分类计数300个细胞，按FAB标准对AL进行分型。

1.3 流式细胞仪免疫分型

1.3.1 仪器与试剂:FACScalibur型流式细胞仪。单抗包括CD 3、CD 5、CD 7、CD 10、CD 13、CD 14、CD 19、CD 20、CD 22、CD 33、CD 34、CD61、CD117、MPO、HLA-DR 等，流式细胞仪及所有单抗均购自当地经销商。

1.3.2 方法:每管培养液中加入经肝素抗凝处理的骨髓液50 μl和3种荧光标记抗体各20 μl，温室孵育30 min，再加入2 ml红细胞溶解液。摇匀后温室放置10 min，PBS洗涤一次并加入1 ml PBS待检。用流式细胞仪测定前，以标准校正荧光微球校正。

1.4 FISH技术

1.4.1 仪器与试剂:ThermoBrite原位杂交仪、尼康荧光显微镜。探针为 BCR-ABL、TEL-AML、PML-RARa、AML1-ETO。购于当地医疗器械供应商。

1.4.2 方法:流式细胞仪免疫分型还不能准确分型的患者，采用FISH技术进行染色体异常检查。取处理过的骨髓液进行固定和预处理，配制杂交液。在杂交前，将探针加入杂交液中，滴在处理过的骨髓细胞上进行杂交。杂交完成后用SSC进行脱洗，在荧光显微镜下观察试验结果。

2 结果

2.1 骨髓细胞形态学检查:细胞形态学正确诊断的AL患者有49例，其中MO-M7型分别为1例、7例、10例、6例、4例、2例、1例、1例，ALL1-ALL3型分别为8例、6例、3例。诊断率为64.47%。

2.2 流式细胞仪免疫分型:经流式细胞仪检测诊断的AL患者有67例，其中AML45例，ALL22例，诊断率为88.16%。8例形态学误诊为AML患者经流式细胞仪免疫分型检测分别确诊为B-ALL(5)、T-ALL(3例)，而9例误诊为ALL的患者分别被确诊为 M1(1例)、M3(4例)、M5(3例)、BAL(1例)。结果见表1。

2.3 FISH技术:剩余的9例患者经过FISH检测，发现5例存在染色体异常，其中t(9;22)1例，t(15;17)1例，t(8;21)1例，t(12;21)2例。联合流式免疫分型总诊断率为94.73%。

表1 经流式细胞仪检测的AL各亚型表型分类

3 讨论

骨髓细胞形态学和组织化学检测主要以形态学为依据，是早期白血病检测的主要手段，但由于白血病细胞具有异质性，在AL的诊断中鉴别ALL和AML具有一定困难。因此，2008年世界卫生组织规定白血病的准断必须联合细胞形态学、免疫学和细胞遗传学的试验室诊断、临床症状和体征［2］。其中，免疫学诊断主要依靠的是流式细胞仪免疫分型，它是基于细胞表面固有标志物的一种检查，既客观又有很好的重复性，在欧美发达国家已经成为临床白血病诊断与疗效监测不可缺少的依据［3-4］。当然这种方法不是万能的，有些白血病并不能通过流式免疫分型来明确诊断，上述试验结果也说明这一点。

在流式免疫分型检测也不能明确诊断时，应采取进一步明确诊断的方法，如FISH。FISH是另一种白血病分型技术，它利用荧光标记单链DNA探针与涂片上白血病骨髓细胞中的互补DNA进行杂交，然后在荧光显微镜下观察，对染色体异常进行诊断。FISH检测价格昂贵，这在临床应用时受到诸多限制。它并不能代替流式免疫分型，但联合应用可使流式免疫分型更为准确和深入，尤其是多色荧光原位杂交技术(M-FISH)的发展。因此，FISH是对流式免疫分型的有益补充［5］。

本研究结果显示，FISH联合流式免疫分型确诊率为94.73%，这一结果优于骨髓形态学检查(64.47%)和单用流式免疫分型(88.16%)。

综上所述，联合应用FISH和流式免疫分型不但可以大大提高AL诊断的正确率，而且可以明确异常细胞的谱系来源，分辨染色体核型异常。同时，对于AL的靶向治疗和判断预后有重要意义。

［1］ 宋国昀.血像、骨髓像形态学改变对儿童白血病诊断分型的意义［J］. 吉林医学，2009，30(15):1594.

［2］ Steven HS，Elias C，Nancy LH，et al.WHO Classofocation of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues［J］.4th edition，2008，WHO Press，WHO:14.

［3］ Peters JM，Ansari MQ.Multiparameter flow cytometry in the diagnosis And management of acute leukemia［J］.Arch Pathol Lab Med，2011，135(1):44.

［4］ Okada Y.Flow cytometry--the basis of cell surface analysis and clinical application［J］.Rinsho Byori，2010，58(11):1121.

［5］ Kearney L.M-FISH:technique，developments and applications［J］.Cytoge-nengt Genome Res，2006，114(3-4):189.