GATA-6蛋白在喉鳞状细胞癌组织中的表达及意义

岳文慧，张立广，于铁莉，陆鸿略，梁 媛，张淑君，赵瑞力

(1承德医学院附属医院，河北承德067000;2河北医科大学第四医院)

喉癌是头颈部常见恶性肿瘤之一，90%以上为鳞状细胞癌。GATA-6是GATA家族成员之一，具有高度保守的锌指结构，能够通过识别GATA序列并与之结合，启动报告基因转录。已有研究表明，在一些肿瘤的发生发展过程中GATA-6具有抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞侵袭、转移的作用。本研究采用免疫组织化学方法检测喉鳞状细胞癌组织中GATA-6蛋白的表达情况，探讨GATA-6蛋白的表达与喉癌发生、发展之间的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2008年1月～2012年4月承德医学院附属医院耳鼻咽喉科住院手术治疗的48例喉癌患者手术切除癌组织(喉癌组)，患者术前均未行放、化疗及免疫治疗。男45例、女3例，年龄为44～78岁;伴有淋巴结转移17例，无淋巴结转移31例(根据术后病理决定有无淋巴结转移);喉癌分型:声门上型16例，声门型32例;肿瘤长径＜3 cm 20例，≥3 cm 28例;病理学分级:高分化鳞癌15例，中分化鳞癌20例，低分化鳞癌13例;临床分期采用2002年UICC TNM分类分期标准，临床Ⅰ期6例，Ⅱ期10例，Ⅲ期22例，Ⅳ期10例。吸烟量(每天量×年×365)≤20万支者11例，＞20万支者37例。另收集20例非喉癌患者的喉部正常黏膜组织作为对照，其性别、年龄与喉癌组比较差异无统计学意义。

1.2 方法

1.2.1 检测方法 新鲜组织均在取材离体后马上放入10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋，制成5 μm厚切片。主要试剂为GATA-6兔抗人多克隆抗体(sc-9055)，来源于美国Santa Cruz公司;即用型快捷免疫组化Max Vision试剂盒为福州迈新生物技术有限公司产品;即用型DAB显色试剂盒来源于北京四正柏生物科技有限公司。采用免疫组织化学法，实验步骤严格按照实验说明书进行。每批实验均参照美国Santa Cruz公司提供的阳性对照片，以PBS代替一抗作阴性对照。一抗稀释比例为1∶100。

1.2.2 结果判定 分别由3名有经验的病理科医生独立阅片，根据其评分的平均值采用Volm双评分法进行判定。①按阳性细胞百分率评分:光镜10×20倍下，随机选择5个染色均匀视野，阳性细胞百分率≤25%为1分，阳性细胞百分率26%～50%为2分，阳性细胞百分率＞50%为3分;②按染色强度评分:无显色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将上述两项得分相加:0～2分判为+，3～4分判为++，5～6分判为 +++。++和+++为阳性表达，+为阴性表达。

1.2.3 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件，组间比较采用χ2检验或Fisher精确概率法。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GATA-6蛋白在喉癌组织的表达情况 GA-TA-6蛋白阳性染色定位于细胞核，阳性表达呈棕黄色颗粒状。GATA-6蛋白在喉癌组织及正常喉部黏膜中均有表达，在喉癌组织中的阳性表达率明显高于正常喉部黏膜组织(75.00%vs 35.00%，P＜0.05)。

2.2 GATA-6蛋白表达与喉癌临床病理因素的关系 GATA-6蛋白在喉癌组织中的表达与淋巴结转移、临床分期、病理分级有关(P均＜0.05)，与临床分型、肿瘤大小、吸烟量、年龄和性别无关。见表1。

表1 GATA-6蛋白表达与临床病理因素的关系

3 讨论

GATA家族共有6个成员，分为两类，GATA-1/-2/-3和GATA-4/-5/-6，它们有完全不同且又相互重叠的作用模式。每一个GATA转录因子的DNA结合域均含有2个相似的Ⅳ型锌指结构，羧基端的锌指结构是结合DNA的主要结构，氨基端的锌指结构与结合稳定性和特异性相关［1］。GATA家族在人体的各种生理病理过程中的作用已成为当今研究的热点，其中GATA-6蛋白由Tamura等［2］首次在兔的胃组织中发现。人类GATA-6基因编码595个氨基酸，在来源于中胚层和内胚层的各种不同组织中表达，调节胃肠、心脏和性腺等多个器官的正常发育和功能形成［3］。

Zhong等［4］研究发现GATA-6作为癌基因在胰腺导管癌中呈高表达，尤其在晚期肿瘤中表达更为明显，其通过激活Wnt信号通路在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用。Adachi等［5］研究发现，致癌通路Ras/Raf/MEK/ERK中Nox 1与多种恶性肿瘤的发生、发展有关，而 GATA-6蛋白的磷酸化，可能是维持这一通路持续上调的原因之一。Shureiqi等［6］研究表明，GATA-6蛋白通过与组蛋白去乙酰化酶相互协同作用，进而抑制15-脂氧合酶-1的表达，降低了过氧化物酶增殖体对受体的激活，从而发挥抑制结肠癌细胞凋亡的作用。Gorshkova等［7］在小鼠肺癌基因K-RAS的12号密码子外显子上发现存在可与GATA-6相结合的位点。同时发现，给肺癌非易感性小鼠C57BL注射致癌物3-MC，DNA与GATA-6的结合活性无明显变化。而给肺癌易感性小鼠ICR注射致癌物3-MC后，DNA与GATA-6的结合活性明显增强，表明GATA-6蛋白与肺癌的发生有关。Belaguli等［8］发现，在结肠癌中 GATA-6蛋白可正向调控尿激酶型纤溶酶原激活物的基因表达，增强结肠癌肿瘤细胞的侵袭性。本研究发现GATA-6在喉癌组织中的阳性表达率明显高于正常喉部黏膜组织，有淋巴结转移者高于无淋巴结转移者，Ⅲ～Ⅳ期者高于Ⅰ～Ⅱ期，低分化者高于高分化者和中分化者。提示GATA-6作为癌基因诱导喉癌细胞生长，随着GATA-6蛋白表达的增强，喉癌细胞侵袭性和转移能力明显增强，表明GATA-6在喉癌的发生、发展过程中起一定的作用，这可能与一些相关的抑癌基因作用被抑制，致癌通路的异常激活及肿瘤转移因子作用增强有关。

总之，喉癌组织中GATA-6蛋白高表达，通过测定GATA-6蛋白的表达量及研究其与临床病理特征之间的关系，进一步深入了解相关调节机制，有望为喉癌诊断、治疗技术的进一步发展奠定理论基础。

［1］史莹华，许梓荣.GATA转录因子研究进展［J］.生物学通报，2005，40(3):1-2.

［2］Tamura S，Wang X H ，Maeda M ，et al.Novelgastric DNA binding proteins recognize upstream sequence motifs of parietal cells pecific genes［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90(22):10876-10880.

［3］Maeda M，Ohashi K，Ohashi-Kobayashi A.Further ext ension of mammalian GATA-6［J］.Dev Growth Differ，2005，47(9):591-600.

［4］Zhong Y，Wang Z，Fu B，et al.GATA-6 activates Wnt signaling in pancreatic cancer by negatively regulating the Wnt antagonist Dickkopf-1［J］.PloS One，2011，6(7):e22129.

［5］Adachi Y，Shibai Y，Mitsushita J，et al.Oncogenic Ras upregulates NADPH oxidase 1 gene expression through MEK-ERK-dependent phosphoryl ation of GATA-6 ［J］.Oncogene，2008，27(36):4921-4932.

［6］Shureiqi I，Zuo X，Broaddus R，et al.The transcription factor GATA-6 is overexpressed in vivo and contributes to silencing 15-LOX-1 in vitro in human colon cancer［J］.FASEB J，2007，21(3):743-753.

［7］Gorshkova EV，Kaledin VI，Kobzev VF，et al.Codon 12 region of mouse K-ras gene is the site for invitro binding of transcription factors GATA-6 and NF-Y ［J］.Biochemistry(Mosc)，2005，70:1180-1184.

［8］Belaguli NS，Aftab M，Rigi M，et al.GATA-6 promotes colon cancer cell invasion by regulating urokinase plasminogen activator gene expression［J］.Neoplasia，2010，12(11):856-865.