葛根素对大鼠颅脑损伤后ICAM－1和NF－κB表达的影响

冯纳婷，冯雅碧

创伤性脑损伤 （traumatic brain injury，TBI）是神经外科最常见的疾病之一，局部组织的炎症反应是继发性脑损伤的重要因素［1］。研究表明，血管内皮表面的细胞间黏附分子 （ICAM－1）可以引起颅脑损伤后脑组织病理生理改变，大量中性粒细胞聚集和黏附于脑血管内皮并浸润到损伤脑组织中［2，3］；核因子－κB （nuclear factor－kappa B，NF－κB） 调控 B淋巴细胞免疫球蛋白κ轻链的基因转录，与机体的炎症过程密切相关［3，4］。葛根素是一种天然多酚类化合物，结构类似雌二醇，具有某些雌激素样作用。研究发现它是一种天然的抗氧化剂，可以清除各种氧自由基和抑制脂质过氧化，保护细胞膜的结构，从而具有抗氧化、降血压、抗癌等多种药理活性，目前研究表明它对大鼠创伤性脑损伤具有一定的保护作用［5］。本试验即通过建立大鼠颅脑损伤模型，给予葛根素治疗后，运用分子生物学手段，分析脑组织中ICAM－1和NF－κB表达的变化，初步探讨葛根素保护颅脑损伤后的分子机制，为葛根素的进一步研究和应用提供理论基础和实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料 丙二醛 （MDA） 和超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。葛根素购自中国药品生物制品检定所，纯度＞98%。ICAM－1和 NF－κB 抗体购自 sigma公司；dNTP和TagDNA聚合酶购自Promega公司。成年健康SD大鼠15只，由第四军医大学实验动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立 建立大鼠颅脑损伤动物模型［6］，随机分为假手术组、模型组和治疗组，每组各5只。腹腔注射4%戊巴比妥钠，沿中线左侧切开头皮，分离骨膜，保持完整硬膜，从高处撞击硬膜，造成颅脑损伤。假手术组仅打开颅骨，不致脑损伤。模型组大鼠，给予生理盐水处理；治疗组大鼠，建立模型前预先口服灌胃50 μmol/L的葛根素7 d。

1.2.2 测定MDA含量和SOD活性 按试剂盒操作说明，通过TBA硫代巴比妥酸法测定MDA含量，黄嘌呤氧化酶法测SOD活性。

1.2.3 RT－PCR 实验 收集各组大鼠脑组织，TRIZOL法提取细胞总mRNA。按照基因BANK序列设计合成引物（大连宝生物公司合成）。ICAM－1上游引物序列，5＇－GGTGGGCAAGAACCTCATCCT－3＇；下游引物序列，5＇－CTGGCGGCT CAGTGTCTCATT－3＇。NF－κB基因序列设计引物，由大连宝生物公司合成：5＇－TCAATGGCTACACAGGACCA －3＇；5＇－CACTGTCAC CTGGAACCAGA－3＇。β－actin 序列：5＇－ATCATGTT TGAGACCTTCAACA－3＇； 反义 5＇－CAT CTCTTGCT CGAAGTCCA－3＇。 RT－PCR 分析 ICAM－1 和 NF－κB mRNA 表达的变化：5 μl PCR 产物，加1 μl的loading buffer混匀，加入样品孔内，电压为5 V/cm，电泳 30 min，终止电泳。 0.5%溴化乙啶（EB）染色，凝胶成像仪观察图像并计算灰度值。

1.2.4 Western blot实验 收集各组大鼠脑组织，加入1 ml胞裂解缓冲液，机械匀浆，12000 r/min，离心30 min，收集上清。取各组蛋白样品进行SDSPAGE凝胶电泳，转膜，5%的脱脂乳封闭非特异性染色，加 ICAM－1 和 NF－κB 一抗（1∶1000），孵育后加过氧化物酶标记的二抗，显色，观察结果。

2 结 果

2.1 各组SOD活性及MDA含量 表1结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠，SOD活性显著降低（P＜0.05），MDA 含量显著增加（P＜0.05），提示模型组动物颅脑损伤明显；经葛根素处理的治疗组大鼠，可以显著增加脑组织中SOD的活性，并降低MDA的含量。

表1 各组SOD活性及MDA含量（±s）

表1 各组SOD活性及MDA含量（±s）

注：与假手组相比，＊P＜0.05；与模型组相比，＃P＜0.05

SOD（NU /mg） MDA（μmol/g）61.46±2.39 2.31±0.21 33.18±1.42＊ 4.64±0.11＊51.36±1.31＃ 2.93±0.3＃分组 n假手术组 5模型组 5治疗组 5

2.2 葛根素对ICAM－1和NF－κB表达的影响RT－PCR结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠脑组织中 ICAM－1和 NF－κB mRNA表达显著升高（P＜0.05，n＝5），经葛根素处理的治疗组大鼠，与模型组大鼠相比较，脑组织中 ICAM－1和 NF－κB mRNA 表达显著降低（P＜0.05，n＝5），结果见图 1。

图1 RT－PCR检测ICAM－1和NF－κB的表达

Western blot结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠脑组织中ICAM－1和NF－κB蛋白表达显著升高（P＜0.05，n＝5），经葛根素处理的治疗组大鼠，与模型组大鼠相比较，脑组织中ICAM－1和NF－κB蛋白表达显著降低（P＜0.05，n＝5），结果见图 2。

图2 Western blot检测ICAM－1和NF－κB的表达

3 讨 论

葛根素是一种多酚类化合物，属植物雌激素类，具有很强的抗氧化活性。葛根素在4位和7位各有1个羟基，可与雌激素受体（ER）相结合，具有抗自由基损伤、扩张心血管、降低心肌耗氧、改善心肌代谢、抑制血小板活化与聚集等作用［7］。细胞间黏附因子－1（ICAM－1）广泛分布于中枢神经系统中，分为跨膜和可溶性蛋白两种形式，可介导多种炎症细胞黏附于血管内皮细胞，是多种炎性因子发挥作用的分子基础［8，9］。 转录因子 NF－κB 主要存在于细胞质中，炎症介质、氧化应激等刺激可激活NF－κB信号转导通路，暴露NF－κB的DNA结合位点，发生核转位，与细胞因子、黏附分子等的启动子或增强子的特异性位点结合，启动基因转录的过程［10，11］。创伤性脑损伤后，局部组织易发生炎症反应，引起继发性脑损伤。如何降低或减弱炎症反应，避免继发性脑损伤的发生，保护受损的脑组织，降低高致残率、病死率，是目前临床研究中亟待解决的问题。

本研究中，通过建立大鼠颅脑损伤动物模型，经葛根素预处理后，分别观察各组大鼠脑组织中SOD活性及MDA含量的变化，结果提示，与假手术组比较，模型组大鼠SOD活性显著降低，MDA含量显著增加（P＜0.05），而经葛根素处理的大鼠，可以显著增加脑组织中SOD的活性，并降低MDA的含量。RT－PCR和Western blot实验分别观察葛根素对ICAM－1和NF－κB mRNA及蛋白表达的影响，结果均显示，与假手术组相比，模型组大鼠脑组织中ICAM－1和NF－κB蛋白表达显著升高，经葛根素处理后，大鼠脑组织中NF－κB蛋白表达显著降低。以上结果均提示，大鼠颅脑受到损伤后，局部组织炎症反应显著，炎症相关指标均发生明显的变化，而经葛根素预处理的大鼠，可以抑制或降低颅脑受到损伤后脑组织中局部炎症反应，调控或影响ICAM－1和NF－κB分子的信号通路，起到脑保护的效应。

本实验以多酚类化合物葛根素为研究对象，通过建立大鼠颅脑损伤动物模型，利用RT－PCR和Western blot等手段，分析和检测大鼠脑组织中血管内皮表面的细胞间黏附分子－1（ICAM－1）和NF－κB的变化，初步探讨葛根素影响颅脑损伤后相关因子表达的作用机制，为葛根素的进一步研究和应用提供理论基础和实验依据。

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