Cu2+对东北林蛙的急性毒性*

金 鑫，周 丹，于 东

(哈尔滨师范大学)

0 引言

两栖动物作为环境监测优良指示动物，在农业生态系统中发挥重要作用．近年来，因两栖动物的种群数量在全球范围内急剧下降，关于环境污染物(农药、重金属)对两栖类毒性效应的研究受到广泛关注［1-4］．

工农业和采矿业产生的大量重金属通过不同途径进入水体，在影响大型水生植物和浮游藻类的同时，对水生动物也具有一定的毒理效应［5］．硫酸铜多年来在水产养殖的疾病防治中经常用作消毒剂和除菌剂，进而成为一种重要的环境污染物．有关Cu2+对两栖动物毒性的研究国内外已有一些报道，涉及到蟾蜍科的毗刺蟾蜍(Bufo juxtasper)、中华大蟾蜍(Bufo gargarizans)、花背蟾蜍(Bufo raddei)、黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus)和绿蟾蜍(Bufo viridis);负子蟾科的光滑爪蟾(Xenopus laevis)和非洲爪蟾(Xenopus laevis);蛙科的牛蛙(Rana catesbeiana)、黑斑蛙(Rana nigormaculata)、泽蛙(Rana limnocharis)、日本林蛙(Rana japonica)和中国林蛙(Rana chensinensis)等两栖类蝌蚪的毒性研究［6-19］．目前还没有关于重金属对东北林蛙毒性作用的相关报道．

该研究以东北林蛙蝌蚪为研究对象，用不同浓度的Cu2+处理东北林蛙蝌蚪，观察其毒性效应，统计并计算半致死浓度(LC50)和安全浓度(SC)．以期为人工养殖、环境保护和治理提供研究材料的同时，也为两栖动物的资源保护提供理论依据．

1 材料和方法

1．1 实验材料

实验材料为野生东北林蛙，种蛙采自黑龙江省尚志市帽儿山地区．在实验室内抱对、产卵和孵化，采用孵化出的同一批蝌蚪，待出膜后发育至33～35期［20］时挑选体质健康、大小一致的个体进行毒性实验．实验开始时受试蝌蚪的平均体重为0．102 ±0．018 g，平均体长(从吻端至尾端)为13．76 ± 0．213mm。

所用染毒试剂为CuSO4·5H2O，分析纯，西安化学厂生产．用蒸馏水配成1500 mg/L Cu2+母液，实验用水为曝气2 d以上的自来水(pH保持在 6．8 ～ 7．0)，采用 39．5 cm × 28．5 cm ×10 cm的塑料方盆作为容器，实验期间水温保持在18～24℃之间．

1．2 实验方法

1．2．1 预实验

预实验在较大的 Cu2+浓度范围进行，通过预实验找出最小的全致死浓度和最大的零致死浓度，然后根据预实验所得出的质量浓度范围来确定正式实验的浓度范围．

1．2．2 正式实验

正式实验采用有毒物质对水生生物急性毒性实验的标准方法［21］．在100%死亡浓度与无死亡浓度范围内设7个 Cu2+质量浓度组，分别为0．01、0．06、0．1、0．3、0．5、1．5 和 2．5 mg/L，另设一个空白对照组，整个实验设3个平行组．每个实验容器盛试液2000 ml，随机放入大小一致的蝌蚪13只，隔24 h换液一次．及时观察和记录蝌蚪的中毒症状，并记录24 h、48 h、72 h和96 h的死亡数量(死亡标准以触及身体不再有反应为准)，随时清出死亡个体．

1．2．3 数据处理

用处理浓度对数与个体死亡率概率单位的关系进行回归分析，得到回归方程，分别计算24、48、72 和96 h 的半致死浓度(LC50)，并采用公式:48 h半致死浓度×0．3/(24 h半致死浓度/48 h半致死浓度)2计算安全浓度［22］．P＜0．01，被认为有极显著相关．统计分析采用SPSS 12．0数据分析软件．

2 结果

2．1 蝌蚪的中毒与死亡症状

通过4 d的观察，东北林蛙的蝌蚪在不同浓度的Cu2+溶液中都出现了不同程度的中毒现象．在较低浓度组中，中毒症状出现的较慢，开始表现出自由游泳的姿态，但几小时后，游动的频率和能力则有所下降．而在较高浓度组，中毒症状表现得比较快而且强烈．但二者的症状相似:中毒后，蝌蚪表现不安，游动剧烈，随后身体失去平衡、游动方式杂乱，身体弯曲，最后反应迟钝，卧于水底不动，用玻璃棒触之，尾部剧烈颤抖，最后死亡，死亡个体尾部上翘呈脱水状．

2．2 暴露浓度、暴露时间与死亡率的关系

在水温18～24℃条件下，Cu2+对东北林蛙蝌蚪的急性毒性实验结果如表1所示．在暴露24 h和48 h时，0．06 mg/L组蝌蚪出现死亡，1．5 mg/L组蝌蚪全部死亡．在暴露 72 h时，0．01 mg/L组蝌蚪出现死亡，0．5 mg/L 组蝌蚪全部死亡．在暴露96 h时，蝌蚪全部死亡的浓度降低为 0．3 mg/L．

根据表1的实验结果，将累计死亡百分率转化为死亡几率单位，Cu2+的质量浓度转化为浓度对数，经回归统计分析，得出其死亡几率单位与浓度对数变化呈线性相关(表2)．

由回归方程可求出Cu2+对东北林蛙蝌蚪作用24 h、48 h、72 h和96 h的半致死浓度(LC50)分别为 0．189、0．118、0．058 和 0．027 mg/L，安全浓度为0．022 mg/L．

表1 不同质量浓度Cu2+处理东北林蛙蝌蚪的累计死亡数和死亡率

表2 Cu2+浓度对数与东北林蛙蝌蚪死亡几率之间关系的回归统计

3 讨论

从Cu2+对东北林蛙蝌蚪的急性毒性实验结果可见，在同一时间内随着Cu2+质量浓度的升高蝌蚪的死亡率逐渐升高，说明在一定浓度范围内，蝌蚪死亡率与Cu2+呈正相关．在同一浓度下随着染毒时间的延长蝌蚪的死亡率也逐渐增高，说明死亡率与 Cu2+暴露时间呈正相关，证明Cu2+对东北林蛙的毒性作用是随着体内Cu2+积累量的增加而增强的．在Cu2+对其他两栖类的毒性研究中也得到了类似的结果，Khangarotdeng等报道 Cu2+对黑眶蟾蜍的 24 h、48 h、96 h LC50值分别为 0．843、0．446、0．32 mg/L［19］;Rao 等报道Cu2+对饰纹姬蛙的24 h、48 h、72 h 、96 h LC50值分别为 5．4、5．0、4．8、4．7 mg/L［23］;Khangarot等报道 Cu2+对六趾蛙的 24 h、48 h、72 h 、96 h LC50值分别为 0．55、0．048、0．043、0．043 mg/L［24］;汪学英等报道Cu2+对黑斑蛙的96 h LC50值分别为 0．206 mg/L［9］;贾秀英等报道 Cu2+对泽蛙蝌蚪24 h、48 h、96 h LC50值分别为 0．98、0．70 和0．43 mg/L［10］;卢祥云等报道 Cu2+对中华大蟾蜍蝌蚪 24h、48h的半致死浓度分别为1．310 mg/L、0．862 mg/L［12］;姚丹等报道 Cu2+对日本林蛙蝌蚪24 h、48 h、72 h 、96 h LC50 分别为0．250、0．143、0．117、0．102 mg/L［13］;石戈等报道 Cu2+对中国林蛙蝌蚪 24 h、48 h、72 h LC50值分别为 0．131、0．105、0．038 mg/L［14］．

毒性回归方程的截距(b值)表示受试动物对外界污染物敏感性的异质程度［25］．96 h回归方程的b值为8．066．表明蝌蚪对Cu2+的异质性很小，即当Cu2+达到一定浓度后，若浓度再稍有提高，将会迅速引起大量死亡．从本实验可见，Cu2+浓度从0．06增至0．5 mg/L时，蝌蚪的死亡率提高了约53．9%，说明东北林蛙蝌蚪群体对Cu2+的异质性小，敏感性强．另外，随着暴露时间的增长，b值增大．说明随着蝌蚪对Cu2+暴露时间的延长，群体的异质性减小，即个体的敏感程度更加接近［12］．在该实验中，回归方程的b值随着时间的延长，呈逐渐增大的趋势，说明随着Cu2+染毒时间的延长，蝌蚪群体对Cu2+的敏感度在增强．显示在长期染毒条件下，较低浓度的Cu2+将可以对东北林蛙蝌蚪产生毒性效应．根据我国地面水环境质量标准的规定，Ⅴ类水域(即农业用水区及一般景区要求水域)的总铜含量在1．0 mg/L以下，尤其是在林蛙养殖中普遍使用0．7 mg/L硫酸铜来进行常规的病害防治［26］，该浓度超出了东北林蛙蝌蚪24 h LC50值0．189mg/L和安全浓度0．022 mg/L．所以在东北林蛙蝌蚪期不宜使用硫酸铜来进行病害防治．上述Cu2+对其他两栖类的半致死浓度也低于硫酸铜的常用处理浓度．因此，在东北林蛙及其他两栖类的养殖和栖息地区对水中的Cu2+进行准确检测具有重要意义．

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