N-cadherin对大鼠脊髓损伤后移植神经干细胞存活、增殖与迁移的影响

颜建辉，黄丽娟，杨 柳，华力明

(湘南学院 1.临床医学系 内科教研室; 2.附属医院 神经内科,湖南 彬州 423000 )

N-cadherin对大鼠脊髓损伤后移植神经干细胞存活、增殖与迁移的影响

颜建辉1,2*，黄丽娟2，杨 柳2，华力明2

(湘南学院 1.临床医学系 内科教研室; 2.附属医院 神经内科,湖南 彬州 423000 )

目的探讨神经钙黏蛋白(N-cadherin)对大鼠脊髓损伤(SCI)后移植神经干细胞(NSCs)存活、增殖与迁移的影响。方法60只SD大鼠随机分为对照组、模型组、移植 1组和移植 2组。横断T12复制SCI模型。移植 1组行原代培养NSCs移植；以lentivirus病毒为载体将N-cadherin转染至原代培养NSCs再植入移植 2组。BBB评分评定大鼠神经功能。术后5、10和15 d免疫荧光检测NSCs存活、增殖和迁移。结果模型组BBB评分显著低于对照组(Plt;0.05)；各移植NSCs组BBB评分均高于模型组(Plt;0.05)，但以移植2组评分最高(Plt;0.05)；移植2组各时间点巢蛋白(Nestin)阳性细胞数量均显著多于移植1组(Plt;0.05)，以15 d 的数量最多(Plt;0.05)；移植2组各时间点Nestin阳性细胞迁移距离显著长于移植1组。结论N-cadherin可以促进NSCs的存活、增殖与迁移，以修复SCI大鼠的神经功能。

神经钙黏蛋白；脊髓损伤；神经干细胞

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是由于外力或其他因素的原发性损伤使得灰质区发生出血性坏死灶，同时造成神经细胞膜和结缔组织的剪切性损伤，致残率高[1]。神经干细胞(neural stem cells, NSCs)的主要功能是修复中枢神经系统损伤的组织，研究证实，NSCs移植可以显著促进内源性神经干细胞的增殖、迁移和神经发生[2]，因而在SCI的治疗中显示了良好的应用前景。研究表明，神经钙黏附蛋白(N-cadherin)在神经轴突的导向生长、靶向识别、以及突触形成中起着重要作用[3]，但是关于N-cadherin对NSCs的存活、增殖与迁移的尚影响鲜有报道，本实验基于此进行研究，以其揭示N-cadherin在NSCs治疗SCI中的作用机制，为SCI的临床研究开辟新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物造模及分组

清洁级雌性SD大鼠60只，体质量200～220 g，孕10～14 d的SD大鼠1只(湘南学院实验动物中心。合格证号：0114866)。60只SD大鼠随机分为对照组、模型组、移植1组和移植2组，15只/组，除对照组大鼠外，腹腔内注入3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉大鼠，参照文献[4]将T12[5]脊髓横行切断，制备脊髓损伤模型，以大鼠麻醉醒后出现双下肢呈现瘫痪等为造模成功。

1.2 主要试剂

巢蛋白(Nestin)抗体、多聚赖氨酸(Chemicon公司)；B27复合物、碱性成纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子(Sigma公司)；胎牛血清、DMEM/F12(1∶1)培养基(Hyclone公司)；DAB显色剂和免疫组化试剂盒(武汉子心生物科技公司)；Trizol试剂盒、RNA 抽提试剂盒(武汉博士德生物有限公司)；N-cadherin单克隆抗体(Abcam公司)；lentivirus病毒(Glibco公司)。

1.3 方法

1.3.1 分离、培养NSCs：将孕SD大鼠处死参照文献[6]的方法分离、培养NSCs，并传代培养，制备NSCs悬液，调整浓度至1×105/mL，加入10 μmol/L的BrdU进行标记[7]，分成两份备用。

1.3.2 N-cadherin克隆及过表达：利用Pubmed查找N-cadherin基因序列如下：上游引物:5′-ACTG AGGAGCCGATGAAGGAACCAC-3′，下游引物:5′-GTTGATGATGAAGATGCCCGTTGGA-3′。利用引物合成软件Primer Premier 5.0设计引物。克隆大鼠N-cadherin全长编码序列，表达于lentivirus病毒载体，经293T细胞包装后，收集病毒，转染至原代培养NSCs，操作参照Lipofectamine 2000试剂说明书。

1.3.3 N-cadherin的表达：分别以Western blot检测原代培养NSCs和病毒感染NSCs中的N-cadherin表达。加入200 μL蛋白裂解液，提取总蛋白，凝胶电泳，操作严格按照试剂盒说明书进行，β-actin 抗体为内参。

1.3.4 NSCs移植：将原代培养NSCs悬液和感染lentivirus病毒的NSCs悬液各10 μL分别缓慢注入到移植1组和移植2组大鼠损伤脊髓内，逐层缝合肌肉和皮肤，碘伏消毒后纱布包扎切口。

1.4 神经功能评分

观察各组大鼠造模后及移植后5、10和15 d的运动情况，以SCI运动功能BBB评分从0～21分对大鼠神经功能进行评价。

1.5 免疫荧光观察Nestin标记细胞

分别于移植后5、10和15 d腹腔麻醉大鼠，多聚甲醛灌注固定，取损伤部位脊髓2 cm，石蜡包埋固定，切片，常规脱蜡，胰蛋白酶消化，羊血清封闭，滴加一抗小鼠抗Nestin抗体(1∶100)，4 ℃过夜，PBS代替一抗作为阴性对照；滴加FITC结合的荧光二抗(1∶100)，以甘油碳酸盐缓冲液封固，荧光显微镜下观察并照相。

1.6 计数损伤脊髓区内存活、增殖的NSCs

以移植处为中心，分别向头端和尾端进行连续横切片，每隔5片取1片，头、尾端各取5片，×400倍视野下计数Nestin阳性细胞数。

1.7 测量NSCs迁移距离

对各组大鼠脊髓进行连续纵切片，每隔5片取1片，免疫荧光染色后，应用激光扫描共聚焦显微镜载物台上标本移动距离测量尺测量 Nestin阳性细胞从头端最远处到尾端最远处之间的距离。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 N-cadherin转染至NSCs后的表达

N-cadherin在转染lentivirus病毒的NSCs中表达显著高于原代培养NSCs(图1)。

2.2 各组大鼠各时间点的神经功能评分

模型组大鼠脊髓损伤评分标准(Basso, Beattie amp; Bresnahan locomotor rating scale, BBB scale)显著低于对照组；两移植组的BBB评分均显著高于模型组(Plt;0.05)，但仍低于对照组(Plt;0.05)，移植时间越长评分越高；在相同时间点，移植2组BBB评分更高(Plt;0.05)(图2)。

2.3 损伤脊髓内存活、增殖的NSCs

移植1组和移植2组移植区域均可见绿色荧光Nestin阳性细胞，细胞核为大小均一的圆形或椭圆形(图3)。随着移植时间延长，两组的Nestin阳性细胞均逐渐增加，以15 d的数量最多(Plt;0.05)，但是在同一时间点，移植2组数量更多(Plt;0.05) (表1)。

A.the primary culture of NSCs; B.infected cells by virus图1 转染的NSCs中N-cadherin的表达Fig 1 Expression of N-cadherin gene in transfected NSCs

With transplantation time prolonged, BBB score increased significantly in transplanting group 1 and transplanting group 2 (Plt;0.05)；At the same time point, BBB score of transplanting group 2 was significantly higher (Plt;0.05)图2 大鼠各时间点BBB评分Fig 2 BBB score of rats in each group at each time

2.4 各移植组损伤脊髓内移植 NSCs 的迁移距离

各移植组均有Nestin阳性细胞从损伤脊髓处移植迁移到脊髓其他部位，各组15 d的迁移距离均要长于10、5 d组(Plt;0.05)。在同一时间点比较，移植2组Nestin阳性细胞的迁移距离更长(Plt;0.05) (表2)。

A,B,C.were Nestin positive cells in transplanting group 1 at 5, 10, 15 days；D,E,F.were Nestin positive cells in transplanting group 2 at 5, 10, 15 days图3 移植1组和移植2组内Nestin阳性细胞Fig 3 The survival and proliferated Nestin positive cells in transplanting group 1 and transplanting group 2(Immunofluorescence staining)

表1 比较两组损伤脊髓内存活、增殖的Nestin阳性细胞数量Table 1 Comparison of the number of Nestin positive cells in the survival, proliferation spinal cordinjury between transplanting group 1 and 2

*Plt;0.05 compared with transplanting group 1.

表2 比较两组损伤脊髓内移植NSCs的迁移距离Table 2 Comparison of the migration distance of spinal cord injuries transplantation NSCs in transplant- ing group 1 and 2(±s,mm, n=15)

*Plt;0.05 compared with transplanting group 1.

3 讨论

由于NSCs终身保持产生祖细胞的能力，在细胞迁移的间断性运动过程中可产生大量神经元，促进神经功能恢复，可作为一种替代手段用于中枢神经损伤、退行性疾病和脑肿瘤等疾病的治疗[8-9]。

神经钙黏附蛋白(N-cadherin)对于肿瘤上皮细胞及表达N-cadherin的血管平滑肌细胞和内皮细胞之间的黏附起着重要作用。N-cadherin 还是一种凋亡抑制因子，可以促进肿瘤细胞的生长和存活[10]。但是其是否参与干细胞的迁移及归巢中，目前尚缺乏完善的研究。

本实验Western blot显示N-cadherin成功转入NSCs中，且呈过表达状态。将原代培养NSCs和含有过表达N-cadherin的NSCs分别植入移植1组和2组大鼠，两组大鼠的下肢运动功能均得到了一定程度的恢复，由此证明，NSCs移植可以修复大鼠损伤脊髓的神经功能。同时实验结果说明移植时间越长，大鼠的运动功能恢复的越好，而且移植2组的大鼠神经功能恢复优于移植1组。

检测SCI大鼠移植NSCs后的存活和增殖情况，发现移植区域附近均可见到大小均一的圆形或椭圆形Nestin阳性细胞，而且均以15 d时Nestin阳性细胞数量最多，说明移植时间越长NSCs的存活和增殖情况越好；但是相比于同一时间点，移植2组Nestin阳性细胞数量更多。研究人员发现各移植组均有Nestin阳性细胞从损伤脊髓处向脊髓其他部位迁移，各组15 d时的迁移距离均明显长于10、5 d组，在同一时间点，移植2组迁移距离则更长，提示移植2组可以促进大鼠NSCs的迁移，且随着时间的增加其迁移范围越广。

综上所述，N-cadherin可以促进NSCs的存活、增殖与迁移，从而修复损伤脊髓大鼠的神经功能，但是其具体作用机制是通过什么样的传导途径发挥的尚需要进一步深入研究，也是研究的新方向。

[1] 邓轶鑫,韩维,朱玉德,等. 大鼠骨髓基质细胞移植治疗急性脊髓损伤的研究进展[J]. 疾病监测与控制杂志,2013,7:24-25.

[2] Park DH, Eve DJ, Sanberg PR,etal. Increased neuronal proliferation in the dentate gyrus of aged rats following neural stem cell implantation[J].Stem Cells Dev,2010,19:175-180.

[3] Malinverno Mat, Carta Mar, Epis Rob,etal. Synaptic localization and activity of ADAM10 regulate excitatory synapses through N-cadherin cleavage[J]. J Neurosci,2010,30:16343-16355.

[4] Reis FM, Esteves AM, Tufik S,etal. Plasma iron levels appraised 15 days after spinal cord injury in a limb movement animal model[J]. Spinal Cord,2011,49:361-364

[5] 吴超,余上斌. 临床相关的脊髓损伤动物模型新进展[J].基础医学与临床,2012,32:969-970.

[6] Zhu LL, Zhao T, huang X,etal. Gene expression profiles and metabolic changes in embryonic neural progenitor cells under low oxygen[J].Cellular Reprogramming,2011,13:113-120.

[7] 张向荣,郭光华,刘德伍,等.人骨髓间充质干细胞的分离培养及BrdU标记鉴定[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13:3618-3622.

[8] 刘斌,董静,刘宁,等.人脂肪组织来源的神经干细胞移植治疗大鼠脑缺血再灌注损伤[J].基础医学与临床,2011,31:789-792.

[9] 石嵘,周珏宇,郑文岭,等.诱导性多潜能干细胞技术及应用研究进展[J].基础医学与临床,2013,33:4-8.

[10] 李克,刘莺,刘文静,等. RNAi 沉默 N-cadherin 表达对EC9706 细胞裸鼠移植瘤生长的影响[J].中国病理生理杂志,2011,27:1537-1543.

Effect of N-cadherin on survival，proliferation and migration of neural stem cells transplanted into injured spinal cord of rats

YAN Jiang-hui1,2*, HUANG Li-juan2, YANG Liu2, HUA Li-ming2

(1.Dept. of Internal Medicine, Xiangnan University；2.Dept. of Internal Medicine, Affiliated Hospital of Xiangnan University, Binzhou 423000, China)

ObjectiveTo investigate the effect on survival，proliferation and migration of NSCs transplanted into SCI of rats.MethodsSixty SD rats were divided into control group, SCI group, transplanting group 1 and transplanting group 2. Using lentivirus virus as a vector, N-cadherin was transfected into primary cultured NSCs to implant in transplanting group 2. Neurological function were evaluated by BBB score. Immumofluorescence was used to detecte the survival，proliferation and migration of NSCs at 5, 10 and 15 d.ResultsBBB score of SCI group was lower than that of control group. BBB score in two transplanted groups increased significantly(Plt;0.05), with most evident in transplanting group 2(Plt;0.05). The number of Nestin-positive cells in transplanting group 2 was more than that in transplanting group 1 at the corresponding time point(Plt;0.05). The number of Nestin-positive cells at 15 d was the most among three time points(Plt;0.05). The immigrating distance in transplanting group 2 was longer(Plt;0.05)．ConclusionsN-cadherin can promote the survival, proliferation and migration of NSCs in SCI rats to repair neurological function.

N-cadherin; spinal cord injury; neural stem cells

2013-02-18

2013-06-26

*通信作者(correspondingauthor)： chenhaojingzhou@163.com

1001-6325(2014)03-0372-04

研究论文

R 74

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