白藜芦醇对结肠癌SW480细胞增殖及MsrA、CXCR4和MMP-13表达的影响

崔运福，郝 涛，赵 硕，王荣华

(滨州医学院 附属医院， 山东 滨州 256603)

白藜芦醇对结肠癌SW480细胞增殖及MsrA、CXCR4和MMP-13表达的影响

崔运福，郝 涛，赵 硕，王荣华

(滨州医学院 附属医院， 山东 滨州 256603)

在许多植物(例虎杖，葡萄等)中都发现有白藜芦醇(Resveratrol,Res)，最近对它抗癌作用的研究比较多[1]。Res可以抑制癌细胞增殖，并抑制癌细胞转移与侵袭，这在以往的体外培养细胞实验已经得到证实[2]，但有关Res抑制结肠癌SW480细胞增殖与转移的报道较少，其抗肿瘤的确切机制亦不清楚。本实验通过研究Res对结肠癌SW480细胞增殖及MsrA、CXCR4和MMP-13表达的影响，为Res今后在临床中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料：低分化结肠癌SW480细胞(由美国Rockville研究所提供)，培养于含10%胎牛血清(Gibco公司)，青、链霉素(各100 U/mL)的DMEM培养基中，置37 ℃、饱和湿度、5% CO2培养箱孵育。Res (Sigma公司)，用DMSO溶解后保存于-20 ℃。

1.2 MTT法检测细胞增殖活性：将处于对数增殖期的结肠癌SW480细胞悬液调整为1×105个/L，接种于96孔培养板，每孔100 μL，置于37 ℃、5% CO2培养箱培养。待细胞贴壁，去除培养基，再加入不同浓度(0、5、10、20和50 μmol/L)Res的培养基，每组设6个平行孔，同时将DMSO对照组置于37 ℃、5%CO2培养箱培养24 h后,每孔加入MTT溶液20 μL, 37 ℃、5% CO2培养箱继续培养4 h，小心吸弃孔内培养基，每孔加入DMSO 150 μL,室温避光振荡15 min，使结晶充分溶解，于酶联免疫检测仪490 nm处检测吸光度值(A值)。细胞增殖抑制率(%)=(1-实验孔A值/6*对照孔A值)。

1.3 细胞划痕实验：将结肠癌SW480细胞接种到6孔板，待细胞汇合后进行划痕，PBS洗1遍，更换为无血清培养基，加入低浓度Res(10和50 μmol/L)24 h后观察划痕距离并拍照。

1.4 Western blot检测蛋白变化情况：弃去细胞培养液，PBS洗细胞3次，细胞刮刀将细胞刮下，离心，加入细胞裂解液(10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4),150 mmol/L NaCl,0.1% SDS,100 μg/mL PMSF,0.5% NP-40,0.5%脱氧胆酸钠)4 ℃冰浴中超声破碎细胞，4 ℃放置待细胞膜破碎，反复涡旋后于4 ℃ 12 000r/min离心，取上清，蛋白定量后，样品经SDS-PAGE分离，蛋白电转至PVDF膜，将PVDF膜在10%牛奶中封闭1 h，加入1∶1 000的一抗，4 ℃温育过夜，洗涤，加入酶标二抗室温1 h，PVDF膜经ECL化学发光底物检测特异蛋白。

1.5 统计学分析：使用SPSS13.0软件进行统计分析。

2 结果

2.1 MTT检测Res对结肠癌SW480细胞的细胞毒性：MTT法确定其给药浓度，分别给结肠癌SW480细胞加入不同浓度Res(0、5、10、20和50 μmol/L)作用24 h，计算出抑制率为0%、5.4%、8.6%、15.3%和23.7%。

2.2 Res抑制结肠癌SW480细胞迁移及侵袭：Res组细胞划痕距离明显低于对照组细胞(图1), Res可以抑制结肠癌SW480细胞的侵袭能力。

图1 SW480细胞迁移及侵袭实验结果Fig 1 SW480 cells migration and invasion

2.3 Western blot 检测蛋白水平：不同浓度Res处理结肠癌SW480细胞24 h后，MsrA表达明显上调，而CXCR4、MMP-13表达量下降(图2)。

2.4 siRNA MsrA后CXCR4与MMP-13的表达情况：永久沉默结肠癌SW480细胞MsrA基因，加入Res，与对照组相比， CXCR4与MMP-13蛋白有所上调(图3)。

*Plt;0.05, **Plt;0.01 compared with 0 μmol/L Res图2 不同浓度Res作用SW480细胞24h后，MsrA与CXCR4、MMP-13蛋白表达的Western blot检测结果及含量变化分析Fig 2 Expression of MsrA, CXCR4 and MMP-13 protein in SW480 cells after treatment with resveratrol of different concentration for 24 hours and analized for changes of these protein

*Plt;0.05, **Plt;0.01 compared with control图3 不同浓度Res作用对照组和siRNA MsrA组24 h后，CXCR4、MMP-13蛋白表达的Western blot检测结果及含量变化分析Fig 3 Expression of CXCR4 and MMP-13 protein in control group and siRNA MsrA group after treatment with resveratrol of different concen- tration for 24 hours and analized for changes of these protein

3 讨论

研究表明，Res具有抗肿瘤特性，可以抑制人乳腺癌细胞、前列腺癌细胞和急性早幼粒白血病细胞的增殖。本实验研究结果提示，低浓度的Res能抑制结肠癌SW480细胞增殖，在未出现凋亡时，Res也可以抑制结肠癌SW480细胞迁徙，用药浓度越高迁徙率越低。

甲硫氨酸亚砜还原酶(methionine sulfoxide reductase A,MsrA)，是Msr家族之一，是一种修复系统的重要蛋白，以往研究表明MsrA表达增加可以明显抑制癌细胞的侵袭能力，同时可以轻度降低其增殖能力，表明MsrA有抑制癌细胞转移与增殖的作用。基因趋化因子受体CXCR4是趋化因子基质细胞衍生因子-1(CXCL12)的特异受体，其与肿瘤的增殖、分化和转移等密切相关。MMP-13 (又称为胶原酶-3)最先在乳腺癌中被发现，以后的研究相继发现在其他肿瘤组织中也发现了 MMP-13 的表达，而癌前和良性病变中MMP-13不表达[3]。

本研究发现，低浓度Res可以使结肠癌SW480细胞内MsrA上调，而CXCR4与MMP-13下调，这与Res的作用有密切关系，低浓度Res在不导致结肠癌SW480细胞凋亡的同时会抑制其侵袭与迁徙，高浓度Res可以诱导多种肿瘤细胞发生凋亡。Res可以激活MsrA蛋白，同时抑制CXCR4与MMP-13蛋白，但沉默MsrA基因，加入Res后，CXCR4与MMP-13蛋白被抑制的作用有所缓解，说明在结肠癌SW480细胞中MsrA在一定程度上起到抑制CXCR4与MMP-13蛋白的作用，更具体机制还有待于进一步实验研究。

[1] 陆艳红,李永军.白藜芦醇在肿瘤基因调控中作用的研究进展[J].现代检验医学杂志,2011,26:20-21.

[2] Shao J,Li X,Lu X,etal. Enhanced growth inhibition effect of Resveratrol incorporated into biodegradable nanoparticles against glioma cells is mediated by the induction of intracellular reactive oxygenspecies level[J].Colloids Surf,2009,72:40-47.

[3] Chris De Savi, Andrew D. Morley,Selective non zinc binding inhibitors of MMP13[J]. Bioorganic Med Chem Lett,2011,14:1215-1219.

2013-07-01

2013-10-09

1001-6325(2014)04-0548-02

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