氮用量对烤烟成熟期叶片碳氮代谢及萜类代谢相关基因表达的影响

王红丽,杨惠娟,苏菲,3,李海江,张要旭,杨军杰,史宏志

1 河南农业大学 烟草学院，河南 郑州 450002；

2河南省烟草公司平顶山市公司，河南 平顶山 467002；

3 云南省烟草公司,昆明市公司东川分公司，云南 昆明 654199

氮用量对烤烟成熟期叶片碳氮代谢及萜类代谢相关基因表达的影响

王红丽1,杨惠娟1,苏菲1,3,李海江2,张要旭2,杨军杰1,史宏志1

1 河南农业大学 烟草学院，河南 郑州 450002；

2河南省烟草公司平顶山市公司，河南 平顶山 467002；

3 云南省烟草公司,昆明市公司东川分公司，云南 昆明 654199

为探索氮用量对烤烟碳氮代谢的影响，在前期不同氮素营养水平上在成熟期统一调亏，分析烤烟叶片糖代谢、氮代谢、淀粉代谢及萜类代谢相关关键基因的表达水平。结果显示：糖代谢中3个关键基因，胞外蔗糖转化酶(Inv)和蔗糖合成酶(SuS)基因随着烟叶的成熟表达量升高，在不同氮水平处理间表达水平差异无统计学意义。蔗糖磷酸合成酶(SPS )基因表达量在烟叶成熟前期随之前施氮量的降低而降低。淀粉代谢中颗粒结合型淀粉合成酶( GBSSI )基因表达量既不受烟叶成熟时期的影响也不受前期供氮水平的影响。氮代谢中硝酸还原酶（NR）基因在不同成熟时期及不同的供氮处理间表达量均无差异。谷氨酰胺合成酶（GS） 基因的表达量在烟叶成熟后期呈降低趋势，且受前期供氮水平的影响较大。萜类代谢途径中3-羟-3甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）基因表达量随着烟叶的成熟先升高再降低，在成熟后期表达量随前期供氮水平的降低而降低。表明在前期供氮水平不一致的基础上于成熟期统一调亏，对成熟后期烟叶氮素的同化吸收过程和萜类代谢影响较大。烟叶糖代谢和淀粉代谢受烟叶成熟时期的影响最大。

烤烟；氮素；碳氮代谢；基因表达

氮素对植物生命活动有极其重要的作用。氮素是蛋白质、核酸、磷脂等的主要组成成分，氮在植物体内的主要存在形态是蛋白质[1-2]。在烟叶各种代谢过程中，碳氮代谢是最基本和最重要的代谢，其代谢强度和协调程度对烟叶的生长发育和决定烟叶产量品质各类化学成分的形成转化有重要影响，直接或间接关系到烟叶产量和品质的形成和提高[3]。拓阳阳[4]研究表明硝酸还原酶和转化酶活性都存在显著性差异，随着烟叶的生长成熟，叶绿素、硝酸还原酶和转化酶活性均呈下降趋势，不同烤烟品种不同生长阶段的碳氮代谢强度具有显著性差异。许晨曦[5]研究表明随氮素水平的提高同一品种烟草的硝酸还原酶、蔗糖转化酶、淀粉酶活性均提高；但在成熟期，增加施氮量后，烟草的淀粉酶活性反而降低。云菲[6]等研究结果表明随着光强的降低转化酶(INV)活性逐渐降低，但充足的氮素营养能够促进碳代谢。随光强减弱和施氮量增加，烟碱、总氮含量上升，碳水化合物含量下降，总体上呈现氮代谢强于碳代谢的趋势。史宏志[7]研究发现，在叶片功能盛期以前，随着施氮量的增加，淀粉酶活性增高，碳的固定和转化增强，但碳积累代谢减弱；烟叶成熟阶段，淀粉酶活性高时，碳的分解代谢旺盛，其活性与施氮量呈负相关。随着施氮水平的增高，烟叶各期的转化酶活性均升高，表明增施氮肥可以促进碳代谢的增强。岳俊芹[8]对不同氮素形态影响的研究发现，纯施硝态氮有利于还原糖的积累；纯施铵态氮的烟叶中谷酰胺合成酶和蔗糖合成酶活性在成熟期一直保持在相对较高的水平上，烟碱含量最高；硝态氮与铵态氮各占50%的情况下，烟叶碳氮代谢协调。

目前，关于氮素营养对烟叶生长发育和品质影响的研究多集中在大田条件下控制氮素用量和氮素形态比例等方面[9-11]，但大田条件下很难实现氮素营养的动态精准调控。氮素供应不足将导致烟叶刺激性降低，劲头不足；氮素过多，则烟株氮代谢旺盛，烟叶难以正常生理成熟。合理的施氮量可以保证烟株正常的生长发育，达到体内碳氮代谢平衡，有利于优良品质的形成。鉴于此，本文采用盆栽试验，在育苗基质固持的条件下进行全营养液培养，使烟株前期生长在不同氮素营养条件下，后期则进行氮素调亏，减少其氮素供应，研究了不同生长时期氮素精准动态供应对烤烟碳氮代谢关键基因表达水平的影响，以期为烤烟的动态精准施肥提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本研究在河南省郏县采用盆栽试验套盆设计，供试品种为烤烟NC297。盆栽试验中种植盆钵高30 cm，直径35 cm，底盆直径40 cm，所用填充固持材料为烤烟育苗基质。烟株生长营养全部由Hoagland营养液提供，营养液组成为NH4NO3、KH2PO4、K2SO4、MnSO4、H3BO3、CuSO4、ZnSO4、EDTAFe、MgSO4、Ca(NO3)2·4H2O、H2MoO4、H2O。采 用分析纯试剂配制Hoagland营养液，营养液中各种元素 N、P、K、Mg、Zn、Cu、Mn、B、Mo、Fe的 质量浓度分别为140、40、300、40、0.05、0.02、0.50、0.50、0.05、5.60 mg/L。

1.2 试验设计

研究设计了前期不同氮素营养协同成熟期氮素调亏试验，共设4个处理，每个处理栽种8盆。烤烟于2012年5月10号移栽，团棵前每5 d添加1次营养液，之后每3 d添加1次营养液。移栽后28 d进入团棵期，移栽后56 d打顶，打顶后进行同量氮素调亏，即把氮素质量浓度降至35 mg/L，Hoagland营养液中其余元素浓度保持不变。团棵前N1、N2、N3、N4处理每次分别添加营养液的体积为：2.250 L、1.875 L、1.500 L、1.125 L，其中N2处理为根据大田推荐施氮量确定的正常施氮量,添加后均按差量用清水补足到2.5 L；团棵后N1、N2、N3、N4处理每次分别添加营养液的体积为：2.725 L、2.213 L、1.700 L、1.188 L，添加后均按差量用清水补足到3.0 L。打顶后各处理每次分别添加营养液的体积均为1 L，按差量用清水补足到2 L。

1.3 碳氮代谢基因和萜类代谢基因的RT-PCR检测

分别在移栽后60 d，70 d和80 d选取生长发育良好的不同烟株的 3 片上二棚叶，于液氮中冷冻保存。采用Trizol 法提取烟草总RNA[12]，通过随机引物法反转录合成cDNA。检测内参基因L25[13]及目的基因lnv、SuS、SPS、GBSS、NR1、GS和HMGR表达量用的引物如表1.PCR体系：cDNA1 μL ，diH2O 为11 μL，上游引物和下游引物均为1.5 μL，含染料的Taqmix 为15 μL，整个PCR体系共30 μL。反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s；退火温度依各引物Tm值变化而变化(47℃～60℃)；72℃延伸1 min；35 个循环；72℃延伸10 min，于4℃保存。

表1 扩增引物序列Tab.1 Amplification primer sequence

1.4 数据处理分析

采用LaunchVisionWorksLS软件对RT-PCR检测所得半定量图片进行量化，提取各个基因表达的亮度相对值进行对比，每个基因均以移栽后60天N2处理为基准。

2 结果与分析

2.1 氮素营养协同成熟期同量调亏处理对糖代谢关键基因表达的影响

胞外蔗糖转化酶(extracellular invertase,Inv)，在高等植物蔗糖代谢中起着关键的作用，参与植物的生长、器官建成、糖分运输、韧皮部卸载及调节库组织糖分构成及水平，其酶活性常作为衡量碳代谢强度的重要指标；如图1表2所示，Inv基因的表达强度随生育期的推进而逐渐增强，移栽后60天表达量均较低，在处理间表现为N1＜N2＜N3＜N4。而在移栽后70天、80天表达量明显增加，70天时处理间没有明显差异，80天时表现为基因表达量随前期施氮量的增加而增加。蔗糖合成酶( sucrose synthase,SuS)主要是将运输入叶片中的蔗糖降解,提供合成淀粉等多糖的葡萄糖供体,承担着非光合组织中为其它合成反应提供核苷酸糖类的任务。SuS基因在不同的生育期表达量不同，随生育期的推进表达量有逐渐增加的趋势，但不如Inv基因表达量增加明显。蔗糖磷酸合成酶( sucrosephosphate synthase,SPS )，是催化蔗糖生成的关键酶，也是控制碳素分配和流向的关键酶[14]。SPS基因在移栽后60天表达强度弱于其余两个时期，SPS基因表达量在移栽后60天时四个处理间有差异，N3处理亮度相对值为59.3明显低于其余各处理，在70天与80天时表达量在发育时期与处理间均无明显差异（图1，表2）。

图1 不同发育时期烤烟 Inv,SuS和SPS基因的检测结果Fig.1 Results of Inv,SuS,SPS genes on different growing stages

表2 氮素营养协同成熟期同量调亏处理对糖代谢关键基因表达的影响Tab.2 Effects of regulated deficit of nitrogen nutrition during mature stage on expression of key genes in carbohydrate metabolism

2.2 氮素营养协同成熟期同量调亏处理对淀粉代谢关键基因表达的影响

颗粒结合型淀粉合成酶( GBSSI )，是控制直链淀粉合成的关键酶。如图2表3所示，GBSSI基因在不同发育时期表达量变化不大，同一时期不同处理间差异不明显，在移栽后70天N4处理表达量相对值为126.9稍高于其余各处理，移栽后80天N4处理表达量相对值为84.0低于其余各处理(图2，表3)。

图2 不同发育时期烤烟GBSSI基金的检测结果Fig.2 Results of GBSSI gene on different growing stages

表3 氮素营养协同成熟期同量调亏处理对GBSSI基因表达的影响Tab.3 Effects of regulated deficit of nitrogen nutrition during mature stage on expression of GBSSI gene

2.3 氮素营养协同成熟期同量调亏处理对氮代谢关键基因表达的影响

硝酸还原酶（NR），是氮代谢的第一个关键酶和限速酶，主要作用是把NO3-离子还原成NO2-离子。如图3表4所示，NR的基因表达量随生育期的推进先升高再降低，在同一时期不同处理间无明显差异。谷氨酰胺合成酶（glutamine synetase，GS,又称为N素转移酶）催化产生谷氨酰胺，GS常与谷氨酸合酶（glutamate synmase，GOGAT）协同作用，组成GS/GOGAT循环，这是高等植物NH4+同化的主要途径。GS基因的表达量在移栽后70天高于其余两个时期，在移栽后60天和70天时各处理间表达量没有明显差异，在80天时N3、N4处理的亮度相对值分别为70.1,54.1明显低于N1,N2处理（图3，表4）。

图3 不同发育时期烤烟NR和GS基因的检测结果Fig.3 Results of NR and GS genes on different growing stages

表4 氮素营养协同成熟期同量调亏处理对氮代谢关键基因表达的影响Tab.4 Effects of regulated deficit of nitrogen nutrition during mature stage on expression of key genes in nitrogen metabolism

2.4 氮素营养协同成熟期同量调亏处理对萜类代谢关键基因表达的影响

3-羟-3甲基戊二酰辅酶A还原酶( HMGR)，是植物甲羟戊酸途径调控的第一个限速酶，也是细胞质萜类代谢中的重要调控位点。如图4表5所示，HMGR基因的表达量在移栽后70天时各处理的基因表达量均高于移栽后60天时的表达量，随之在移栽后80天时表达量又逐渐降低。四个处理间的表达量有明显差异，在移栽后60天N3,N4处理HMGR基因表达量亮度相对值分别为204.5,183.0明显高于N1,N2处理，移栽后70天N1处理亮度相对值为387.9明显低于其余各处理，移栽后80天表现为随前期施氮量的增加基因表达强度增强(图4，表5)。

图4 不同发育时期烤烟HMGR基金检测结果Fig.4 Results of HMGR gene on different growing stages

表5 氮素营养协同成熟期同量调亏处理对HMGR基因表达的影响Tab.5 Effects of regulated deficit of nitrogen nutrition during mature stage on expression of HMGR gene

3 讨论

在烟叶生长和成熟过程中其碳氮代谢的动态变化对烟叶品质都会产生重大影响[3]。本研究表明，糖代谢中3个关键基因，胞外蔗糖转化酶和蔗糖合成酶基因表达均受烟叶成熟时期的影响较大，烟叶越趋向成熟其基因表达量越高，而不受前期氮素施用量影响，在各个时期的4个处理间2个基因的表达量均无差异。但SuS基因的表达量整体低于Inv基因。SPS基因的表达量在烟叶成熟前期随打顶前施氮量的降低而降低，随着烟叶成熟期的退后表达量在4个处理间趋于一致。糖代谢3个关键基因表达量的变化说明打顶后随着烟叶的成熟糖代谢关键基因表达量均趋向升高，表明糖代谢活动也越来越活跃，糖代谢过程受烟叶成熟时期影响较大而受前期氮素施用量影响较小。

淀粉代谢中颗粒结合型淀粉合成酶( GBSSI )基因表达既不受烟叶成熟时期的影响也不受前期供氮水平的影响，表明前期供氮对淀粉合成代谢影响不大。

氮代谢中硝酸还原酶（NR）基因在不同成熟时期和不同的前期供氮处理间表达量均无差异。N素转移酶GS基因 的表达强度在成熟前期无差异，越到烟叶成熟后期表达量越低且随前期供氮水平的降低表达量也降低。结果说明氮代谢途径中烟叶固氮能力随着烟叶的成熟而降低，且前期供氮水平越低氮素吸收能力也将越低。

萜类代谢MVA途径中3-羟-3甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGR是控制萜类代谢的限速酶，其表达量随着烟叶的成熟先升高再降低，在成熟前期表达量在四个处理间均较低，在成熟中期表达量都升高，而在成熟后期表达量随即又降低，但在这一时期表达量受前期供氮水平的影响，前期供氮越高，其表达量也越高。结果表明萜类代谢在烟叶成熟中期最活跃，前期供氮水平对烟叶成熟后的萜类代谢影响最大。

综上所述，在前期供氮水平不一致的基础上成熟期统一调亏，对烟叶糖代谢和淀粉代谢影响不大，而对成熟后期烟叶氮素的同化吸收过程和萜类代谢影响较大。

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Effects of nitrogen on expression of key genes related to carbon/nitrogen metabolism and terpenoid metabolism in matruing flue-cured tobacco leaves

WANG Hongli1,YANG Huijuan1,SU Fei1,3,LI Haijiang2,ZHANG Yaoxu2,YANG Junjie1,SHI Hongzhi1

1 College of Tobacco,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China;
2 Henan Pingdingshan Tobacco Company,Pingdingshan 467002,Henan,China;
3 Kunming Dongchuan Tobacco Company,Yunnan Provincial Tobacco Company,Kunming 654199,China

Expression of key genes involved in sugar,nitrogen,starch and terpenoid metabolism pathways were tested by regulated deficit nitrogen nutrition to study effects of different nitrogen applications on carbon and nitrogen metabolism in flue-cured tobacco.Results indicated that in sugar metabolism pathway Inv and SuS genes’ expression increased when tobacco leaf became more mature while not affected by early nitrogen level.Expression of SPS gene decreased with decline of nitrogen supply at early maturing stage.GBSSI gene in starch metabolism pathway was not affected by either maturity or early nitrogen supply.GS gene expressed at lower level in maturing stage and affected by early nitrogen supply while NR gene expression was not affected.HMGR gene expression in terpenoid metabolism pathway decreased when leaf became more mature and decreased with decline of early nitrogen supply.The assimilation of nitrogen and terpenoid metabolism were significantly affected when regulated deficit of nitrogen was applied at early growing stage.Sugar and starch metabolism were affected mostly at leaf maturing stage.

flue-cured tobacco; nitrogen; carbon and nitrogen metabolism; gene expression

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.05.019

S572.6; Q81 文献标志码：A 文章编号：1004-5708（2014）05-0116-05

河南省烟草公司科技项目（HYKJ2012M06）

王红丽（1989—），在读硕士，主要从事烟草栽培生理研究,Email：379714360@qq.com

史宏志（1963—），博士，教授，博士生导师，主要从事烟草栽培生理研,Email:shihongzhi88@163.com

2013-10-14