百会透悬厘针刺对脑出血模型大鼠脑组织NGF蛋白表达的影响*

李雪岩，李德韬，付洪瑜，牛霏霏，孔 莹△，孙忠人

(1.黑龙江中医药大学第二附属医院，黑龙江哈尔滨150001;2.大庆油田总医院脑血管医院，黑龙江大庆163000;3.黑龙江省康复医院，黑龙江哈尔滨150018;4.北京中医药大学东方学院，河北廊坊065001;5.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨150040)

在临床上应用百会透悬厘针刺治疗脑出血患者，收到较好疗效，针刺可以激活脑细胞，促进神经细胞分化，而真正起作用的是神经生长因子(NGF)，它有维持交感神经的细胞的存在的作用，轴突的生长方向也需要它的参与，无论周围神经还是中枢神经的修复也是离不开它的参与。作用机理是使Ca2+水平在细胞内保持稳定，使兴奋性氨基酸的毒性得到有效的拮抗，另外能起到抗自由基的作用。现在对脑出血的治疗已从单纯内科治疗转为针对脑出血病理生理机制的治疗，少针透刺是导师多年临床经验的心得。为了提供有效地理论支持，开辟新的治疗途径，特进行相关的基础研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康清洁级雄性Wistar大鼠，总重量(280±10)克，由黑龙江中医药大学提供。

1.2 实验设备

①307－6型台式牙钻机(中国上海齿科医械厂);②立体定位仪ZH－蓝星B型(中国安徽仪器厂);③生物组织包埋机KH－BL(湖北孝感阔海医疗科技有限公司);④微量注射器;⑤石蜡切片机LEICA RM 2135石(中国天津航空机电公司);⑥自动脱水机XGQ－15/20(泰州世纪康峰机电制造有限公司);⑦展片机TEC－2601型(常州市郝思琳医用仪器有限公司);⑧烤片机PPTHK－21B(上海精密仪器仪表有限公司);⑨恒温低温冰箱;⑩电热恒温箱;⑪电子天平FA1004N(郑州时代仪器设备有限公司);⑫病理图像分析系统JD801(江苏省捷达科技发展有限公司);⑬数码相机(日本);⑭Motic image 3.2 图像分析软件(Motic公司生产)。

1.3 实验试剂

①PV－6001二步法免疫组化检测试剂(北京中杉金桥生物有限);②NGF免疫组化试剂盒(武汉博士德生物有限公司);③DAB显色试剂盒(天津百浩生物科技有限公司);④多聚赖氨酸(广州市一科生物有限公司);⑤Na2HPO4·12H2O，分析纯(北京康普汇维科技有限公司);⑥多聚甲醛，分析纯(北京康普汇维科技有限公司);⑦NaCl，分析纯(广州市一科生物有限公司);⑧NaH2PO4·2H2O，分析纯(北京康普汇维科技有限公司)。

1.4 实验动物分组

将80只健康雄性大鼠随机取8只作为对照组，剩余72只造模成功后随机分为模型组、药物组、针刺组。药物组与针刺于造模成功6 h后，给予相应的药物与针刺治疗，然后在对应的时间点停止治疗并取材。

对照组(A):8只，不做手术处理，断头取材。

模型组(B):24只，分为2天、7天、14天时间点，每点8只大鼠，造模后2天、7天、14天分别取材。

药物组(C):24只，分为2天、7天、14天3个时间点，每点8只大鼠。造模成功6 h后，给予脑活素稀释液灌胃(按人:大鼠体重为200∶1配置)。2天组连续灌胃2天，1 ml每天1次;7天、14天同上，然后分别取材。

针刺组(D):24只，分为2天、7天、14天3个时间点，每点8只大鼠，造模成功6 h后，给予针刺治疗，1次/天。针刺病灶侧百会穴透悬厘穴，取穴方法参照华兴邦等制定的《实验动物穴位图谱》留针30 min，期间捻转1次，每次1 min，以200转/min速度捻针。针刺治疗后于2天、7天、14天分别取材。

1.5 脑出血模型的制备

根据大鼠脑立体定位图谱确定右侧尾壳核位置。采用脑内定向注射胶原酶诱发大鼠ICH模型。将大鼠用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，俯卧位固定于立体定位仪上，使上门齿钩平面比耳间线平面低2.4 mm，这样大鼠前囟和后囟在同一水平面上。取头皮正中，备皮消毒，正中切口，长度约1 cm，骨膜剥离器剥离骨膜，暴露前囟及冠状缝，取前内点(Bregma)右旁开3.5 mm、后0.2 mm定点，用牙科钻钻直径为1.0 mm的圆孔，深达硬脑膜表面，将微量注射器固定于立体定位仪上，沿钻孔垂直进针约6 mm，用自动推进器按每只 0.8 U(0.1 U/μL)胶原酶Ⅶ，以 1 μL/min的速度缓慢匀速注入右侧尾状核，缓慢出针。缝合头皮，局部皮肤采用碘酚消毒，防止局部感染影响指标观察。

1.6 标本取材

麻醉，暴露取材心脏，必须左心室插管最后抵达升主动脉根部，于右心耳剪0.2 cm口做出口。将9%氯化钠200 ml灌注，等到流出的变清澈，换100 ml的4%多聚甲醛灌注，等到标本变硬。断头取脑，冠状切片，厚度约5 mm部分标本将其放入含有千分之一的DEPC的4%多聚甲醛1/0.1MPBS固定液中固定，然后按常规脱水、浸蜡、包埋制成厚度5 um的石蜡切片用于HE染色，NGF免疫组化检测。

1.7 NGF免疫组织化学检测

①切片脱蜡;②放在30%H202溶液中孵育8 min，PBS洗5 min3次;③热抗原修复:将切片浸入0.01 mol/L，PH6.0构椽酸盐缓冲液中，加热至95℃30 min，室温冷却30 min，PBS洗5 min;④滴加正常山羊血清封闭液30℃孵育30 min;⑤滴加一抗40℃孵育过夜;PBS洗5 min3次;⑥滴加入生物素化二抗工作液37℃孵育30 min，PBS洗5 min 3次;⑦DAB显色:使用DAB显色试剂盒，取1 ml蒸馏水，加试剂盒中试剂各l滴，均匀后加至切片，室温撇色，镜下控制反应时间，一般在8 min左右蒸馏水洗涤;⑧苏木素复染，脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观测。

1.8 NGF阳性细胞表现

血肿周围脑组织中:在显微镜下观测，DAB显色阳性细胞呈淡棕黄色或淡褐色，利用Motic image 3.2图像采集系统采集图像并进行分析，在Motic－BA400倍显微镜视野下观察。

1.9 统计学处理

采用SPSS17.0的软件进行统计。计量数据以均数±标准差(±s)表示。各实验组间的两两比较采用t检验，以P＜0.05为有显著差异，以P＜0.01为有极显著差异。

2 结果

2.1 大鼠脑组织中NGF检测的阳性细胞数比较

由表1可见，A组与B组比较均有意义。造模后2天，D组与B组比较有显著性差异(P＜0.01)，D组和C组两者结果有差异(P＜0.05)。造模后7天、14天C组与 B组比较，NGF阳性细胞数增高(P＜0.05)，D组与B组相比，NGF阳性细胞数明显增高(P＜0.01)D组和C组两者结果有差异(P＜0.05)。

表1 各组大鼠NGF阳性细胞数比较(±s)

表1 各组大鼠NGF阳性细胞数比较(±s)

注:与A 组比较，*P ＜0.05;与B 组比较，▲P ＜0.05，△P ＜0.01;与C组比较，●P＜0.05。

组别 n 2天 7天 14天空白组8 656.50 ±4.29 656.51 ±4.28 656.49 ±4.29模型组 24 700.30 ±4.01* 722.01 ±7.65* 741.50 ±8.51*西药组 24 801.25 ±6.51 840.31 ±6.51 862.01 ±6.78▲针刺组 24 858.83 ±3.16△● 912.03 ±3.50△● 986.96 ±3.51△●

2.2 大鼠脑组织NGF阳性细胞平均光密度值比较

由表2可见，针刺组及西药组周围脑组织中NGF阳性细胞平均光密度值，随不同的时相点变化而逐渐增加，与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。针刺组与西药组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。

表2 大鼠不同时相点周围脑组织NGF阳性细胞平均光密度值的比较(±s)

表2 大鼠不同时相点周围脑组织NGF阳性细胞平均光密度值的比较(±s)

注:与 B 组比较，*P ＜0.01;与 C 组比较，△P ＜0.01。

组别 n 2天 7天 14天空白组8 0.31 ±0.01 0.31 ±0.004 0.31 ±0.004模型组 24 0.31 ±0.01 0.33 ±0.004 0.35 ±0.004西药组 24 0.40 ±0.01* 0.42 ±0.01* 0.45 ±0.01*针刺组 24 0.48 ±0.01＊△ 0.52 ±0.004＊△ 0.58 ±0.004＊△

3 讨论

本实验通过对比研究表明:针刺治疗效果优于药物治疗组，而对于主要调控机理也是本实验的研究内容。目前很多基础研究证明氧自由基介导的脂质过氧化物反应参与了脑出血的过程并使之加重，这一过程在很多的颅脑损伤中已经被证实［1－2］。本实验通过头穴透刺提高了NGF的表达，而NGF可以提高损伤皮层内的神经元中超氧化物歧化酶以及谷肤甘肤还原酶的活性，因此，NGF有着重要的意义，在神经修复这一复杂过程中起到了决定性的作用。

另一方面，本实验中给予脑活素治疗也提高了NGF的表达，这说明营养脑细胞的药物对于治疗脑出血也有效，查阅相关文献也提供了相似的结论，如王艳辉等［3］通过使神经细胞凋亡，然后给予低剂量的可控制的来源于外部的NGF，经实验研究得出结论:浓度为100 ug/L的NGF可以有效的缓解与兴奋性氨基酸毒性引起的脑细胞凋亡。此外蔡晶等［4］通过药物干预对因血管病变而导致痴呆的模型大鼠皮质相关区域神经生长因子表达研究，观察神经细胞微结构、传递信息的突触使者数密度、NGF有效阳性指标的神经元光密度值等一系列手段证明:药物可以提高NGF表达，可以有效的促进皮层相关神经元中NGF的含量，能够改善脑卒中后神经细胞的损伤。而刁士元［5］采用了新的模型建立方法，提高了造模的成功率，使颞叶缺血病灶更准确，成功的建立了再灌注模型，然后给予一定量的来自自体以外的NGF，目的是观察这一方法是否有效，通过一系列的研究结果发现，来自外部的NGF有效地抑制了细胞凋亡的发生，同时也降低了细胞的损伤，对已经受损的神经元细胞起到有效的修复作用。

本实验证明透刺可以减少脑细胞的死亡、修复神经，而其内在调控因子较多，NGF为其中之一。此外，也有学者提出NGF对脑细胞有修复作用，如石秋艳等［6］及邹伟等［7］对脑组织内的NGF以及相关因子的研究指出:在未手术组见少量阳性细胞出现，而脑出血组随着时间的推移而增长，说明NGF对脑细胞是有修复作用的。无论是外源性还是内源性的NGF都对神经元细胞存在修复作用，同时它对轴突生长的方向，也起着重要的作用。而导师在临床用本法治疗脑出血患者，收到较好疗效，故通过本实验研究进一步提供理论依据。针刺治疗中风病历史悠久，在临床实践中更是效果突出。脑出血后通过少针透刺治疗是未来的趋势，有待为本疗法提供更多的临床和基础研究依据。

通过本实验说明“百会透悬厘”针刺法能促进受损神经的修复;并修复在急性期脑出血中受损的细胞。

［1］GuoZ，KindyMS，KrumanI，et al.AL S － linkedCu ZnrSOD mutation impairs cerebralsynaptic glucose and glutamate transport and exacer bates ischemic braininjury［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2000，20:463－468

［2］PhilipsMF，MattiassonCT，WielochT，et al.Neuroprotective and behav ioral efficacyof nerve growth factor transfected hippocam paI progenitor cell transplants afterexperimenta ltraumatic brain injury［J］.J Neurosurg，2004，94(2):765 －774

［3］王艳辉，赵冬宝，赵春玉，等.神经生长因子对新生的大鼠小脑皮质神经细胞凋亡的影响［J］.中国临床康复，2005，9(9):50－51

［4］蔡晶，杜建，葛振华，等.康欣胶囊对血管性痴呆模型大鼠皮质顶叶、海马CA1区神经生长因子表达的影响［J］.中国老年学杂志，2005，25(2):157 －159

［5］刁士元.神经生长因子对大鼠局灶性脑缺血再灌注后细胞凋亡的影响［J］.临床神经病杂志，2004，17(6):450 －451

［6］石秋艳，何俊芳，孙惠芳，等.脑出血大鼠脑内NGF和BDNF蛋白表达变化的研究［J］.中国医药指南，2010(7):7

［7］邹伟，刘芳，孙晓伟，等.头针对急性脑出血大鼠BDNF和NGF表达的影响［J］.中医药学报，2010(6):13