联合检测外周血及腹水中CK20水平对结直肠癌微转移的意义

孙立辉，王大巍，樊毅

(辽宁医学院附属第三医院普外二科，辽宁 锦州 121000)

腹腔内微量游离癌细胞或微小癌灶的微转移是导致结直肠癌患者术后腹膜播散、复发和转移的重要原因，严重影响了结直肠癌患者的预后，及早的发现肿瘤微转移成为后续治疗、延长生存期的关键。CK20 在以腺癌为常见的结直肠癌中高表达，具有严格的上皮组织特异性，在癌变的上皮组织以及转移灶中均有表达，而在正常血、淋巴结及骨髓中均为阴性［1-2］。通过FACTT 联合检测外周血和腹水中CK20 水平，提高循环肿瘤细胞的检出率，对结直肠癌微转移具有一定的临床意义。

1 临床资料

1.1 一般资料 我院2012 年11 月至2014 年1 月收治的结直肠癌病人56 例，男性32 例，女性24例，年龄55～73 岁，中位年龄(57 ±6.6)岁。术前均未行放、化疗，术前经肠镜活检病理回报支持诊断，其中直肠癌36 例，结肠癌20 例;高分化腺癌27 例，中分化腺癌17 例，低分化腺癌12 例。TNM 分期:I 期10 例，Ⅱ期14 例，Ⅲ期24 例，Ⅳ期8 例，术后均行6 疗程的规范FOLFOX4 方案化疗。

1.2 标本收集 术前1 d 采取清晨空腹静脉血5 mL，去除前2 mL 防止表皮细胞污染，FACTT 法备检。术中无瘤接触情况下注入生理盐水200 mL，轻轻混合后吸出150～200 mL，若已有腹水直接吸出于4 ℃，1 500 r/min，离心10 min，收集细胞沉淀，保存于-70 ℃冰箱待提取腹腔冲洗液细胞总RNA。

1.3 标本检测 FACTT 方法:取96 孔板一块，每孔加60 μL 捕获抗体4 ℃过夜.加10 g/L 酪蛋白封闭液，22 ℃1 h，加20 μL 待检抗原22 ℃孵育1 h。加20 μL 稀释的生物素化检测抗体(120 mg/L)22 ℃孵育1 h。加5 mg/L 链亲和素22 ℃孵育1 h。加500 mg/L 生物素化DNA 22 ℃孵育1 h。洗板液PBST (含1 mL/L Tween20 的PBS)洗板6次，在每次结合孵育后。洗板后，每孔加20 μL 反应混合液，组成:60U T7RNA 聚合酶(ambion)，1.25 μmol NTP，XT7 缓冲液。37 ℃孵育3 h。加入RNase 抑制剂，加20 mL RiboGreen (1∶200 稀释)。在荧光光谱仪上测量(激发波长485 nm，发射波长35 nm);ELISA 与FCM 按说明书进行。

1.4 统计方法 采用SPSS17.0 统计软件包，率的比较采用χ2检验。

2 结 果

56 例结直肠癌患者中，无论是外周血或是腹水中，FACTT 方法对结直肠肿瘤患者的CK20 阳性检出率明显高于常规的ELISA 和FCM 方法(P ＜0.05)，并且在术后随访证实的外周血联合腹水的FACTT-T7RNA 的阳性率达到73.21% (41/56)，较单独的方法进行检测具有显著的统计学意义(P＜0.01);检测出的CK20 阳性检测结果表明外周血与腹水中癌细胞的检出与结直肠癌的TNM 分期、分化程度相关［3］，随着肿瘤分期的提高，CK20 检出率越高，分化较差的肿瘤细胞，CK20 高表达，具体情况见表1 和表2。

表1 外周血中CK20 的阳性表达与肿瘤的关系

表2 腹水中CK20 的阳性表达与肿瘤的关系

3 讨 论

尽管结直肠癌的综合治疗手段取得了很大的进步，但临床上未发生明显转移的结直肠癌术后也有30%的患者2 年内复发［4］，提示即使临床分期为早期的结直肠癌患者在接受治疗时，已经发生了目前常规的病理学检查所不能发现的远处转移，因此，探讨结直肠癌早期敏感指标的筛选成为研究的热点。

FACTT-T7RNA 方法是ZHANG 等［5］建立的一种检测血清蛋白质及基因蛋白的新技术，用来检测结直肠癌肿瘤细胞，就是通过特异性的单抗将肿瘤细胞表面的特异性肿瘤抗原同生物素化的DNA 连接起来，具有等温、成线性定量的特点，可进行实时荧光定量分析，单位细胞数阳性率高，扩增和检测可以同步进行，避免假阳性率发生，检测快速，易于操作。朱自满等［6］成功应用FACTT 建立了检测人CEA 的方法，结果表明其检测敏感度较ELISA 增高125 倍，较RT-PCR 技术增高近30倍。CK20 在上皮源性恶性肿瘤细胞中呈高表达［7-8］，且在肿瘤侵袭、转移扩散过程中保持相对稳定。腹腔灌洗液中游离的RNA 易被降解，若检测到CK20 基因，则意味着存在表达该基因的肿瘤细胞，因此CK20 作为结直肠癌微转移的检测是可信的，是检测结直肠癌患者脱落肿瘤细胞存在的重要依据。

研究结果显示，FACTT 法检测肿瘤患者外周血及腹水中CK20 基因表达阳性率分别为57.14 和30.36，较常规检测手段检出率明显高，单纯对照ELISA、FCM 的检测，检出敏感性显著提高，差异具统计学意义。在肿瘤的TNM 分期中，在Ⅲ、Ⅳ肿瘤的术前评估转移的患者外周血及腹水中，FACTT 方法检测CK20 的阳性率较高，提示晚期肿瘤患者的微转移高表达;本研究可以看出，肿瘤的分化程度越高脱落的几率较大，本组病例高分化肿瘤无论在外周血或腹水中，检出率均较高，Koutarou Maeda 等［9］研究证实高分化腺癌较中、低分化腺癌脱落的细胞多，有统计学差异，而联合的FACTT 检测，CK20 阳性率高达73.21%，表现出与肿瘤分期及分化程度高度一致的结果，避免了单纯的外周血或腹水检测的假阴性率，可作为临床筛选的检测手段。

本组患者常规术后复查CT，以发现腹腔淋巴结转移肿大为计数标准，FACTT 联合检测的CK20阳性例数达到41 例(外周血30 例，腹水11 例)，其中在外周血术前FACTT 检测的32 例阳性，2 例患者术后无肿瘤转移表现，均为Ⅰ期低分化腺癌;腹水的FACTT 检测中术后无肿瘤转移表现6 例，其中Ⅰ期4 例，低分化腺癌3 例，中分化粘液腺癌1 例，Ⅱ期2 例，均为低分化腺癌。术前联合检测证实的CK20 阳性患者中共8 例术后未出现肿瘤转移，例数较少且不具备独立因素，无统计学意义，考虑与肿瘤的分期较早，低分化程度相关。Kodera等［10］报道腹腔冲洗液中CK20 水平可能是结直肠的独立预后因素，本研究结果也看到如此倾向，手术后转移的病例11 例，其CK20 水平在第一次手术时腹水检测为阳性，提示腹腔冲洗液中CK20 的水平异常是肿瘤复发和转移的高危因素。与术后无瘤生存率密切相关，并有显著性差异。但是否是结直肠癌独立预后因素，有待于更长期随访结果的获得后进行分析。

早期发现微转移并予以合理的治疗，及时阻断肿瘤的复发和转移是提高生存率的关键，利用FACTT 方法的外周血和腹水的CK20 联合检测，对肿瘤患者的微转移对肿瘤的分期治疗复发及预后都有重要意义。

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