JNK 磷酸化Bad在脑缺血神经元凋亡中的作用

王晓天+刘晓梅+尤红娟+李小翠+秦苏萍+汤仁仙+宋远见

[摘要] 目的 探讨JNK磷酸化Bad在大鼠缺血性神经元凋亡中的作用。 方法 20只大鼠均分为4组：假手术组、缺血复灌组、溶剂对照组和SP600125组。制作大鼠全脑缺血模型，应用免疫沉淀和免疫印迹法检测大鼠脑缺血复灌1 d海马CA1区神经元Bad与14-3-3及Bad与Bcl-Xl的结合、Bad丝氨酸128位磷酸化[p-Bad（S128）]水平、Caspase-3蛋白表达情况。 结果 与缺血复灌组相比，SP600125组海马CA1区神经元Bad与14-3-3的结合明显增高，Bad与Bcl-Xl的结合、p-Bad（S128）、Caspase-3表达显著减少（均P<0.05）。 结论 JNK介导的Bad（S128）磷酸化在大鼠缺血性脑损伤中发挥了重要作用。

[关键词] Bad；JNK丝裂原活化蛋白激酶类；凋亡；脑缺血

[中图分类号] R743.31 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）31-0001-03

Effects of Bad phosphorylation induced by JNK on cerebral ischemic neuronal apoptosis

WANG Xiaotian LIU Xiaomei YOU Hongjuan LI Xiaocui QIN Suping TANG Renxian SONG Yuanjian

Department of Pathogenic Biology and Immunology， Xuzhou Medical College， Xuzhou 221002， China

[Abstract] Objective Investigate the effects of Bad phosphorylation induced by JNK on cerebral ischemic neuronal apoptosis in rats. Methods Twenty rats were divided into 4 groups averagely： sham operation group， ischemia-reperfusion group， solvent control group and SP600125 group. Making rat model of cerebral ischemia， the binding of Bad and 14-3-3，the binding of Bad and Bcl-Xl， Bad phosphorylation at serine 128（p-Bad（S128）） and Caspase-3 protein expression in hippocampal CA1 region were detected by immunoprecipitation（IP） and immunoblotting（IB） 1d after ischemia-reperfusion. Results Compared with the ischemia-reperfusion group， the binding of Bad and 14-3-3 was increased， the binding of Bad and Bcl-Xl， p-Bad（S128） and Caspase-3 protein expression in hippocampal CA1 region were decreased in SP600125 group （All P<0.05）. Conclusion Bad phosphorylation at serine 128 induced by JNK playe important effects on cerebral ischemic neuronal apoptosis in rats.

[Key words] Bad； JNK mitogen-activated protein kinases； Apoptosis； Cerebral ischemia

Bcl-2 antagonist of cell death（Bad）是Bcl-2家族促凋亡蛋白之一，在缺血性脑中风引起的神经元凋亡中发挥了重要作用。Bad丝氨酸136位被Akt磷酸化后即可与14-3-3蛋白结合，形成一个非活化的复合体，阻止Bad介导的凋亡[1，2]；相反，在凋亡刺激下，Bad去磷酸化与14-3-3分离，转位到线粒体外膜与Bcl-Xl形成异二聚体，中和后者的抗凋亡作用[3]。最近有人报道，c-Jun氨基末端激酶（JNK）可使Bad丝氨酸128位磷酸化，诱导细胞凋亡[4]。为此，本实验利用大鼠全脑缺血模型，通过注射JNK抑制剂SP600125，观察其对海马CA1区神经元Bad（S128）磷酸化水平、Bad线粒体转位及Caspase-3蛋白表达的影响，探讨JNK介导的Bad磷酸化在大鼠脑缺血性神经元凋亡中的重要作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 正常健康雄性SD大鼠20只，体重250～300g，由徐州医学院实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂 Bad、14-3-3抗体（Santa Cruz Biotechnology公司），Bcl-Xl抗体（Cell Signaling Biotechnology公司），p-Bad（S128）抗体（Biosource公司），active-Caspase-3抗体（Sigma公司），SP600125（Biomol公司）。

1.2 方法

1.2.1模型制备及分组 20只大鼠均分为4组：假手术组、缺血复灌组、溶剂对照组和SP600125组。采用四动脉结扎法制作全脑缺血模型[5]，将大鼠麻醉后，分离其双侧颈总动脉并电凝椎动脉，次日于清醒状态下结扎双侧颈总动脉，全脑缺血15 min，再灌注1 d处死，为缺血复灌组。假手术组的处理同缺血复灌组，但不结扎双侧颈总动脉。SP600125组将3 g/L的SP600125溶于1%二甲基亚砜（DMSO），于缺血前20 min脑室注射，10 μL/只，10min内注射完[6]。溶剂对照组于缺血前20min脑室注射等体积1% DMSO。

1.2.2 样本制备 大鼠脑缺血15 min再灌注1 d后，断头快速取脑，分离双侧海马，沿海马裂将其分为CA1和CA3-DG两部分，CA1部分置液氮中冻存备用。以下操作均在冰水浴中进行：从液氮中取出海马CA1部分加匀浆缓冲液，匀浆，1000×g离心15 min，小心移取上清液，主要为海马的胞浆部分，BCA法测蛋白浓度后行免疫沉淀及免疫印迹分析。

1.2.3免疫沉淀 取等量胞浆部分蛋白质样品，加入5倍体积IP缓冲液，以25 μL蛋白A/G-琼脂糖预吸附1 h，10 000×g离心2 min，取上清，加入1～2 μg 抗体，旋转混匀过夜，再加入25 μL蛋白A/G-琼脂糖，旋转混匀2 h，10 000×g离心2min，沉淀用IP缓冲液洗3遍，蛋白变性处理后，10 000×g离心2 min，吸上清行免疫印迹分析， 以Bad/14-3-3、Bad/Bcl-Xl分别表示胞浆中Bad与14-3-3、Bad与Bcl-Xl蛋白结合情况。

1.2.4免疫印迹 取等量的变性蛋白质样本（100μg）或IP样本，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移至硝酸纤维素膜，封闭，一抗4℃过夜，二抗室温孵育2 h，显色。扫描膜上显色条带并用ImageJ软件分析，蛋白表达相对值以各组蛋白灰度值与内参GAPDH灰度值的比值来表示。

1.3 统计学处理

所有数据均以x±s表示。采用SPSS16.0软件进行统计学分析，多样本均数比较用单因素方差分析，多样本均数的两两比较采用q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组p-Bad（S128）蛋白表达水平的比较

与假手术组相比，缺血复灌组、溶剂对照组和SP600125组p-Bad（S128）水平明显增高；与缺血复灌组和溶剂对照组相比，SP600125组的p-Bad（S128）水平显著降低（P均<0.05）。溶剂对照组与缺血复灌组差异无统计学意义，4组Bad蛋白表达水平差异无统计学意义（P均>0.05）。详见图1、表1。

图1 4组大鼠海马CA1区神经元p-Bad（S128）、Bad蛋白表达

表1 4组大鼠海马CA1区神经元p-Bad（S128）蛋白表达水平比较（x±s，n=5）

注：F=103.76，P<0.05；1vs2，q=0.871，P>0.05；1vs3，q=12.226，P<0.05； 1vs4，q=21.435，P<0.05；2vs3，q=11.356，P<0.05；2vs4，q=20.565，P<0.05； 3vs4，q=9.209，P<0.05

2.2 4组Bad与14-3-3及Bad与Bcl-Xl结合、Caspase-3蛋白表达水平的比较

与假手术组相比，缺血复灌组、溶剂对照组和SP600125组Bad与14-3-3的结合减少，Bad与Bcl-Xl结合、Caspase-3表达水平增多；与缺血复灌组和溶剂对照组相比，SP600125组Bad与14-3-3的结合明显增多，Bad与Bcl-Xl的结合、Caspase-3表达水平显著降低（P均<0.05）。溶剂对照组与缺血复灌组相比，Bad与14-3-3及Bad与Bcl-Xl结合、Caspase-3表达水平差异无统计学意义（P均>0.05）。4组14-3-3、Bcl-Xl蛋白表达水平差异无统计学意义（P均>0.05）。详情请参见图2、表2和表3。

图2 4组大鼠海马CA1区神经元Bad与14-3-3及Bad与Bcl-Xl结合、14-3-3、Bcl-Xl和Caspase-3蛋白表达

表2 4组大鼠海马CA1区神经元Bad与14-3-3结合情况比较

（x±s，n=5）

注：F=53.508，P<0.05；1vs2，q=8.006，P<0.05；1vs3，q=14.932，P<0.05； 1vs4，q=15.832，P<0.05；2vs3，q=6.926，P<0.05；2vs4，q=7.826，P<0.05； 3vs4，q=0.901，P>0.05

3 讨论

哺乳动物中，Bcl-2家族成员多达20余种，他们均分别含有1-4个Bcl-2同源结构域（Bcl-2 homology domain，BH domain）。根据所含BH结构域及功能的不同，Bcl-2家族蛋白被分为三类：含有BH1-BH4 保守结构域的凋亡抑制蛋白如Bcl-2，Bcl-Xl，Bcl-w等；含有BH1-BH3结构域的凋亡促进蛋白如Bax，Bak等；只含有BH3结构域的凋亡促进蛋白如Bad，Bim，DP5，Bid等[7]。Bad是Bcl-2蛋白家族中的促凋亡成员，它的功能主要是由磷酸化状态的变化来调节的，由此调控下游蛋白之间的相互作用和亚细胞定位[8]。研究发现，细胞存活信号激酶Akt可磷酸化Bad丝氨酸136位，Bad磷酸化后与胞浆蛋白14-3-3结合，消除Bad的促凋亡功能[9]。而在凋亡刺激下，Bad去磷酸化后与14-3-3分离，并转移至线粒体外膜，与Bcl-Xl结合形成异二聚体，抑制后者抗凋亡活性。因此，一直以来，人们认为非磷酸化的Bad是它的活化形式，Bad磷酸化后即失去凋亡活性。但是，最近有人发现Bad丝氨酸128位被JNK磷酸化后，却可成为它的活化形式，诱导细胞凋亡[4]。

JNK是丝裂原活化的蛋白激酶家族的成员，可被紫外线照射、炎性因子、生长因子撤除等多种凋亡刺激所激活[10-11]。JNK信号通路在脑缺血再灌注诱导的神经元凋亡中发挥了重要作用。短暂脑缺血后JNK即被激活[12]，激活的JNK顺次磷酸化其核底物如c-Jun和胞浆底物如Bcl-2、14-3-3等，诱导神经元凋亡。本实验为了证明脑缺血中JNK能否磷酸化另一胞浆底物Bad，我们选择了JNK特异性抑制剂SP600125作为工具药进行研究，结果显示：与缺血复灌组相比，SP600125组的p-Bad（S128）蛋白表达明显降低，提示在脑缺血复灌过程中JNK可以使Bad（Ser-128）磷酸化。

接着，我们检测到：与缺血复灌组相比，SP600125组Bad与14-3-3的结合明显增高，Bad与Bcl-Xl的结合、Caspase-3蛋白表达显著减少。结果提示，JNK磷酸化Bad（S128）后干扰了Bad与14-3-3的结合，Bad随后与14-3-3分离，转位到线粒体外膜与Bcl-Xl结合，促进了线粒体内凋亡因子的释放，进而诱导神经元凋亡。Bad（S128）磷酸化后之所以会诱导Bad线粒体转位，可能是由于Bad丝氨酸128位与丝氨酸136位在空间构型上比较接近，丝氨酸128位磷酸化修饰从空间构型上干扰了丝氨酸136位与14-3-3的相互作用[4]。然而，丝氨酸128位磷酸化也可能是通过与其他蛋白相互作用，破坏了14-3-3与磷酸化的丝氨酸136位的结合[9]。研究发现，在正常细胞内，Bcl-xL与Bax结合形成异源二聚体，阻止Bax同源二聚体的形成，抑制Bax的促凋亡作用[13]。当受到凋亡刺激时，Bad以其自身的BH3结构域与Bcl-xL结合，使得原来与Bcl-xL相结合的Bax释放出来，Bax形成同源二聚体并插入线粒体外膜，引起线粒体通透性转变孔道的开放[14]，导致细胞色素C的释放。细胞色素C与Apaf-1结合，后者同时与死亡效应子前体Caspase-9相互作用形成凋亡小体，活化的Caspase-9继而活化下游的Caspase-3等蛋白酶。激活的Caspase-3可激活CAD（caspase-activated DNase），并可切割核DNA修复酶PARP[poly（ADP-ribose） polyrerase]，从而使核DNA不可复性损伤，最终导致细胞凋亡。正常情况下，Caspase-3蛋白酶以无活性的前体形式定位在胞浆中，只有当细胞凋亡时才被切割激活为有活性的Caspase-3，因此，本实验用抗active-Caspase-3抗体作免疫印迹分析，检测胞浆中切割后Caspase-3的活性片段。

总之，本实验证实了脑缺血复灌过程中JNK可以使Bad（S128）磷酸化，且Bad（S128）磷酸化后，干扰了Bad与14-3-3结合，Bad转位到线粒体，诱导神经元凋亡。因此，JNK介导的Bad（S128）磷酸化在大鼠缺血性脑损伤中发挥了重要作用。Bad磷酸化状态是决定细胞存活或是死亡命运的关键性因素之一，Bad也许会成为预防和治疗缺血性脑中风的一个新的药物作用靶点。

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（收稿日期：2014-08-18）

接着，我们检测到：与缺血复灌组相比，SP600125组Bad与14-3-3的结合明显增高，Bad与Bcl-Xl的结合、Caspase-3蛋白表达显著减少。结果提示，JNK磷酸化Bad（S128）后干扰了Bad与14-3-3的结合，Bad随后与14-3-3分离，转位到线粒体外膜与Bcl-Xl结合，促进了线粒体内凋亡因子的释放，进而诱导神经元凋亡。Bad（S128）磷酸化后之所以会诱导Bad线粒体转位，可能是由于Bad丝氨酸128位与丝氨酸136位在空间构型上比较接近，丝氨酸128位磷酸化修饰从空间构型上干扰了丝氨酸136位与14-3-3的相互作用[4]。然而，丝氨酸128位磷酸化也可能是通过与其他蛋白相互作用，破坏了14-3-3与磷酸化的丝氨酸136位的结合[9]。研究发现，在正常细胞内，Bcl-xL与Bax结合形成异源二聚体，阻止Bax同源二聚体的形成，抑制Bax的促凋亡作用[13]。当受到凋亡刺激时，Bad以其自身的BH3结构域与Bcl-xL结合，使得原来与Bcl-xL相结合的Bax释放出来，Bax形成同源二聚体并插入线粒体外膜，引起线粒体通透性转变孔道的开放[14]，导致细胞色素C的释放。细胞色素C与Apaf-1结合，后者同时与死亡效应子前体Caspase-9相互作用形成凋亡小体，活化的Caspase-9继而活化下游的Caspase-3等蛋白酶。激活的Caspase-3可激活CAD（caspase-activated DNase），并可切割核DNA修复酶PARP[poly（ADP-ribose） polyrerase]，从而使核DNA不可复性损伤，最终导致细胞凋亡。正常情况下，Caspase-3蛋白酶以无活性的前体形式定位在胞浆中，只有当细胞凋亡时才被切割激活为有活性的Caspase-3，因此，本实验用抗active-Caspase-3抗体作免疫印迹分析，检测胞浆中切割后Caspase-3的活性片段。

总之，本实验证实了脑缺血复灌过程中JNK可以使Bad（S128）磷酸化，且Bad（S128）磷酸化后，干扰了Bad与14-3-3结合，Bad转位到线粒体，诱导神经元凋亡。因此，JNK介导的Bad（S128）磷酸化在大鼠缺血性脑损伤中发挥了重要作用。Bad磷酸化状态是决定细胞存活或是死亡命运的关键性因素之一，Bad也许会成为预防和治疗缺血性脑中风的一个新的药物作用靶点。

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（收稿日期：2014-08-18）

接着，我们检测到：与缺血复灌组相比，SP600125组Bad与14-3-3的结合明显增高，Bad与Bcl-Xl的结合、Caspase-3蛋白表达显著减少。结果提示，JNK磷酸化Bad（S128）后干扰了Bad与14-3-3的结合，Bad随后与14-3-3分离，转位到线粒体外膜与Bcl-Xl结合，促进了线粒体内凋亡因子的释放，进而诱导神经元凋亡。Bad（S128）磷酸化后之所以会诱导Bad线粒体转位，可能是由于Bad丝氨酸128位与丝氨酸136位在空间构型上比较接近，丝氨酸128位磷酸化修饰从空间构型上干扰了丝氨酸136位与14-3-3的相互作用[4]。然而，丝氨酸128位磷酸化也可能是通过与其他蛋白相互作用，破坏了14-3-3与磷酸化的丝氨酸136位的结合[9]。研究发现，在正常细胞内，Bcl-xL与Bax结合形成异源二聚体，阻止Bax同源二聚体的形成，抑制Bax的促凋亡作用[13]。当受到凋亡刺激时，Bad以其自身的BH3结构域与Bcl-xL结合，使得原来与Bcl-xL相结合的Bax释放出来，Bax形成同源二聚体并插入线粒体外膜，引起线粒体通透性转变孔道的开放[14]，导致细胞色素C的释放。细胞色素C与Apaf-1结合，后者同时与死亡效应子前体Caspase-9相互作用形成凋亡小体，活化的Caspase-9继而活化下游的Caspase-3等蛋白酶。激活的Caspase-3可激活CAD（caspase-activated DNase），并可切割核DNA修复酶PARP[poly（ADP-ribose） polyrerase]，从而使核DNA不可复性损伤，最终导致细胞凋亡。正常情况下，Caspase-3蛋白酶以无活性的前体形式定位在胞浆中，只有当细胞凋亡时才被切割激活为有活性的Caspase-3，因此，本实验用抗active-Caspase-3抗体作免疫印迹分析，检测胞浆中切割后Caspase-3的活性片段。

总之，本实验证实了脑缺血复灌过程中JNK可以使Bad（S128）磷酸化，且Bad（S128）磷酸化后，干扰了Bad与14-3-3结合，Bad转位到线粒体，诱导神经元凋亡。因此，JNK介导的Bad（S128）磷酸化在大鼠缺血性脑损伤中发挥了重要作用。Bad磷酸化状态是决定细胞存活或是死亡命运的关键性因素之一，Bad也许会成为预防和治疗缺血性脑中风的一个新的药物作用靶点。

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（收稿日期：2014-08-18）