HAIN用于检测原发性耐药结核的研究

刘亚芹，杨振斌，冯冬霞

（聊城市传染病医院 检验科，山东 聊城252000）

HAIN是由德国Hain Lifescience公司推出的一种检测结核菌对异烟肼和利福平是否耐药的技术，该技术基于多重PCR扩增，扩增产物通过反向杂交技术与预先固化在试纸条上的特异性探针杂交，通过杂交条带的显色情况来判定结核菌对利福平和异烟肼的耐药性。HAIN技术6h出结果，比常规比例法药敏（60天）快的多。原发耐药结核病是指没有接受过抗结核药物治疗而发生耐药的菌株感染引起的疾病，对该病的耐药检测常规采用比例法，我国每年新发结核病人近百万，如此严重的疫情，急需新的检测方法，我们通过收集新发涂阳结核病人的痰标本，对标本分别进行培养、比例法药敏和HAIN（线性探针）检测，来分析HAIN在原发耐药结核检测中的可行性。

1 材料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 标本来源 随机抽取我市2012年7月至2013年3月新发痰涂片阳性的病人338例，选其痰标本2个。一个用HAIN检测，一个进行培养和比例法药敏。

1.1.2 标准菌株 H37RV即结核分枝杆菌（ATC C27294），由山东省胸科医院汉光国际感染疾病研究中心赠与。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器 ①HAIN方法：生物安全柜、博日Life Touch基因扩增仪、Twincubator杂交仪、水浴锅、超声破碎仪、离心机、杂交仪，水浴锅，移液器（1000μl，200μl，10μl）3套。②培养和比例法药敏设备：培养基蒸汽凝固灭菌器，ZHN－4型，中国原子能科学研究院；电子天平，FA1604型，上海舜宇恒平科学仪器公司，精度达1／10000级。

1.2.2 试剂 ①HAIN方法，试剂：消化前处理液（4%NaOH，2.94%柠檬酸钠，NALC），无菌 PBS，无菌蒸馏水，PNM，热启动Taq酶试剂盒，分子生物级水，Genotype试剂盒，蒸馏水。②比例法，标准麦氏比浊管，抗结核药物纯品：异烟肼（INH）、利福平（RIF）、氧氟沙星（OFL）、卡那霉素（KM）纯粉，对硝基苯甲酸（PNB）培养基、噻吩－2－羧酸（TCH）培养基、L－J罗氏培养基。

1.3 方法

1.3.1 比例法 按照结核病诊断细菌学检验规程[1]进行如下操作。a.培养基制备：①基础培养基：中性罗氏培养基。②含药培养基：INH、RIF溶解、稀释于基础培养基中分装7ml／管，斜置于蒸汽凝固灭菌器内，85℃凝固50min。制成的培养基37℃无菌试验24h，检查无污染，4℃避光保存，1个月内使用。b.培养。c.药物敏感性试验：制备菌悬液，刮取菌龄2－3周的结核分枝杆菌菌落（刮取斜面各个部分培养物），研磨，以0.5%吐温－80生理盐水稀释，配成1mg／ml菌悬液。用22SWG标准接种环取2满环1mg／ml菌液，平移至2ml灭菌生理盐水中，即成10－2mg／ml菌液，再以同法稀释成10－4mg／ml菌液，用22SWG标准环分别取1满环10－2mg／ml和10－4mg／ml菌液，用划线法均匀接种至含药培养基和对照培养基斜面上，37℃培养4周后报告结果。若耐药百分比大于1%，则判耐药。耐药百分比＝含药培养基的菌落数／对照培养基的菌落数×100%。

1.3.2 HAIN方法 a.DNA提取：取痰标本转移到50ml离心管，中和离心法进行处理后，取1ml转入1.5ml离心管。每管加150μl无菌水，95度水浴20min，超声裂解15min，12 000rpm离心5 min。上清转移到1.5ml离心管。b.PCR扩增：扩增体系配制50μl，取5μl DNA样本到扩增体系中，15min 95℃1个循环，30sec95℃10个循环，2min 58℃、25sec 95℃、40sec、53℃、40sec 70℃30个循环，8min 70℃1个循环。c.杂交20μl变性液（DEN），20μl扩增产物混匀入槽，室温5min，加1 ml 45℃预热的 HYB（杂交缓冲液），放入DNA.strip，45℃30min，吸出 HYB，加 1ml漂洗液（STR），45℃15min，吸出STR，加入按1∶100稀释的底物，室温30min，吸出，洗涤3次，加底物显色液室温10min，加1ml水洗两次。d.结果判读说明：每个探针试条27个条带，共4个区域：1区含3个条带为标记物质控、扩增质控、结核分枝杆菌复合群（TUB）；2区为rpoB区含13个条带分别是rpoB位点质控、rpoB野生条带1到8（rpoBWT1、rpoBWT2……rpoBWT8）、rpoB突变条带4条（rpoBMUT1、rpoBMUT2A、rpoBMUT2B、rpoBMUT3）；3区为katG区含4个条带分别是katG位点质控、katG野生条带（katGWT1）、katG突变条带2条（katGMUT1、katGMUT2）；4区为inhA 区含8个条带分别是inhA位点质控、inhA野生条带2条（inhAWT1、inhAWT2）、inhA 突变条带5条（inhAMUT1、inhAMUT1、inhAMUT2、inhAMUT3A、inhA3B）。耐药：WT条带缺失或MUT条带出现；敏感：所有 WT条带都出现且所有MUT条带缺失；结核分枝杆菌复合群：TUB条带出现；未检测到结核分枝杆菌：TUB条带缺失。

1.4 统计学处理

应用SPSS13.0软件进行数据处理，对两种方法在结核分枝杆菌耐药检测中的比较采用配对四格表资料的χ2检验，P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 比例法结果

338例新发涂阳病人中，共培养出336株菌株，其中2株为污染，336例菌株经PNB、TCH初步鉴定，323株为结核分枝杆菌，13株为非结核分枝杆菌，对这13例病人HAIN方法的检测结果均为：未检出结核分枝杆菌（TUB条带缺失）。这323例结核病人的菌株被纳入比较分析，其比例法的药敏结果是257株对INH、RIF两种药物全部敏感，18株只对INH耐药，10株只对RIF耐药，耐多药（同时耐INH和RIF）的38株。

2.2 HAIN的结果、并与比例法比较

HAIN的结果是，56株比例法检出为INH耐药株（含38株同时耐INH和RFP的菌株）中，45株HAIN检测为耐药，其中katG（WT缺失，MUT1出现）35例，该情况在异烟肼耐药中出现最多，占到了77.8%，其他包括katG（WT缺失，MUT2出现）4例，InhA （WT1缺失，MUT1出现）3例，InhA（WT2缺失，MUT3A出现）3例。48株比例法检出为RIF耐药株（含38株同时耐INH和RFP的菌株）中，46株检出为RIF耐药，其中rpoB（WT8缺失，MUT3出现）22例，该情况在利福平耐药中出现最多，占到了47.8%，其他包括rpoB（WT7缺失，MUT2A出现）8例，rpoB（WT3或和 WT4缺失，MUT1出现）5例，rpoB（WT7缺失，MUT2B出现）3例，rpoB（WT7缺失，MUT全缺失）3例等。

HAIN与比例法对异烟肼耐药性检测的结果比较如下表1所示，χ2＝0.05，P＝0.823，两种方法在检测结核菌对异烟肼耐药中差异无统计学意义，其灵敏性和特异性分别为80.4%和96.6%。

表1 HAIN与比例法对异烟肼耐药性的检测结果比较（以比例法为金标准）

对利福平耐药性检测结果的比较如下表2所示，χ2＝0，P＝1.000，两种方法在检测结核菌对利福平耐药中差异也无统计学意义，其灵敏性和特异性分别为95.8%和99.6%。

表2 HAIN与比例法对利福平耐药性的检测结果比较（以比例法为金标准）

HAIN与比例法对耐多药结核检测结果的比较如下表3所示，χ2＝0.07，P＝0.790，两种方法在对耐多药结核的检测中差异也无统计学意义，其灵敏性和特异性分别为78.9%和97.9%。

表3 HAIN对耐多药结核的检测结果与比例法比较（以比例法为金标准）

3 讨论

HAIN技术，通过检测RIF耐药相关基因rpoB、INH的耐药基因KatG、inhA基因启动子的野生型及突变型，来判断是否耐药。在利福平耐药菌株中95%以上是由于rpoB基因突变所致[2]HAIN法对RIF的检测结果与比例法的药敏复合较好，说明ropB、katG、inhA基因作为结核分枝杆菌耐药性快速诊断标志具有很好的代表性，并且rpoB的位点突变中，531（对应 HAIN中rpoB的MUT3）、526（对应 HAIN 中rpoB的 MUT2A、MUT2B）位的突变最为常见[3]，除上述两位点外，516（对应HAIN中rpoB的MUT1）等也是引起耐药的原因。在对INH的检测中，有20%的耐药菌株 HAIN未检出，原因有可能是，除KatG、inhA外，KaSA和ahpc基因也与异烟肼的耐药有一定的关系，ahpc基因突变可导致ahpc表达增强，它的过量表达可以补偿因KatG基因突变的损失，一般将ahpc基因作为KatG基因损伤的标志[4]，另外，除突变引起耐药外，分枝杆菌存在药物主动外排泵的表达，并被视为是可能的另一种重要耐药机制[5，6]。

HAIN技术也有一定的局限性，操作过程中提取结核菌DNA时，因结核菌的细胞壁坚韧，裂解困难，提取效率不是太高，如果痰标本中结核菌数目少，或存在抑制DNA的物质，都可能造成假阴性[7]，另外HAIN中的PCR试验很容易造成实验室污染，可能导致假阳性。

38例耐多药结核患者中，比例法显示广泛耐药（XDR）的5例。本文应用HAIN技术中的 MTBDRplus，在检测了结核菌对异烟肼、利福平的耐药性后，又通过HAIN的另一项MTBDRs／检测了38例耐多药结核对氟奎诺酮、乙胺丁醇、氨基糖苷类／环肽类抗生素的耐药性，结果与比例法的药敏也有很高的一致性。

我国是27个结核病高负担国家之一，不合理用药、治疗管理不善、药物供应不足与质量不佳以及间断用药等导致耐多药病例的发生，这些病例在未被发现或未得到有效治疗时，作为传染源，可使新被感染而发病的人，从一开始就是原发耐药结核病患者。因此尽快发现和治疗耐药结核病人非常重要，只有减少了耐药结核的病人，减少其在正常人群中传播，才能有效减少原发耐药结核病的发生，而HAIN的快速特点恰恰适合这一需求。我们通过HAIN技术对结核的原发耐药性进行研究，了解了新发结核病人的耐药特性，为临床诊断、选择和调整原发耐药结核病的治疗方案及时提供参考依据，在积极应对结核尤其是原发耐药结核方面，HAIN与比例法相比差异无统计学意义，又因其快速，所以HAIN具有重要的应用价值。

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