不同结扎方法对失神经支配大鼠牙周炎的影响

高 艳 孙 静 高玉光 郭晶晶 王青山

牙周病是危害人类口腔健康的主要疾病之一，是成人失牙的主要原因。牙周病的发生、发展及治疗转归与全身及局部多种因素密切相关。研究表明，神经因素对牙周病的发生、发展及组织修复有重要的影响，但其作用机制并不清楚。以失神经支配的牙周炎动物模型来研究两者之间的关系是目前较为理想的研究方法。在本课题前期研究中，成功利用丝线结扎加高糖饮食的方法建立了失神经支配下的大鼠牙周炎实验模型[1]。本实验比较了采用不同材质的结扎丝在建立牙周炎动物模型中的优劣，探讨一种更快速、更有效的建立失神经支配的牙周炎动物模型的方法。

1.材料和方法

1.1 实验动物及分组 80只2月龄SPF级体重300±25g Wistar雄性大鼠(山东大学动物实验中心提供)。随机分为5组，每组16只，即假手术组(N)、离断下牙槽神经+丝线结扎(P1)组、离断下牙槽神经+正畸结扎丝结扎(P2)组、单纯丝线结扎(P3)组、单纯离断下牙槽神经(P4)组。

1.2 实验方法 大鼠称重后，10%水合氯醛按0.4ml/100g剂量腹腔麻醉，15-30#K型根管锉依次适当扩大左侧下颌第一磨牙与第二磨牙之间牙间隙，剥离牙龈。P1组双股3-0丝线结扎左侧第一磨牙，并将结扎线尽量置于龈沟内，暴露并离断同侧下牙槽神经[1]，术后高糖饲料和200g/L高糖水进行喂养[2]；P2组用直径为0.25mm的正畸结扎丝结扎左侧第一磨牙牙颈部，离断同侧下牙槽神经，术后高糖饮食喂养；P3组仅用双股丝线结扎左侧第一磨牙，术后高糖饮食喂养；P4组仅离断左侧下牙槽神经而不结扎第一磨牙，术后常规鼠粮和水喂养；N组暴露但不离断神经，术后常规喂养。

1.3 观察指标

1.3.1 大体观察 在1周、2周、4周、6周分别对牙龈指数、出血指数、牙齿松动度、牙槽骨吸收情况、牙龈退缩的程度及牙周袋深度进行检测。

1.3.2 针刺实验 在各时间段对大鼠左侧下颌区域行针刺实验，测定下牙槽神经功能。

1.3.3 X线检查 在各时间段分别用新鲜配制4%多聚甲醛溶液行心脏体外循环内灌注，初步固定后，分离其下颌骨并截取磨牙段，拍摄X线片。

1.3.4 组织病理学观察 标本用100mL/L甲醛液固定6h，15%EDTA脱矿，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片厚5μm，常规HE染色，光镜观察。

2.结果

2.1 大体观察 术后约2-3h后苏醒。术后1-2d，实验动物少量进食，厌活动。3-4d后渐渐恢复正常。创口愈合良好，无感染，无一意外死亡。

2.1.1 P1组 1周时，大鼠进食减少，体重下降，丝线周围食物及软垢滞留量多，无松动脱落现象；牙龈退缩，探诊出血，根分叉区暴露，牙齿Ⅰ度松动。2周时，牙龈退缩明显，根分叉暴露，与对侧呈贯通状吸收，牙齿Ⅲ度松动。结扎4周，牙龈从牙面剥离，质地松软，探针出血明显，有牙周溢脓倾向。牙龈退缩至根尖1/3处，牙根暴露处有牙石形成。结扎6周，牙龈退缩严重，炎症充血不明显，牙根周围有牙石形成。

2.1.2 P2组 结扎1周，左侧下颌下缘伤口处愈合良好，结扎丝无松动及脱落现象，牙龈充血、水肿，轻度退缩。结扎2周，牙龈水肿，色泽暗红，龈沟加深，钢丝结扎打结处有轻微龈增生。结扎4周,炎症、水肿十分严重，牙龈从牙面剥离,钢丝结扎处形成牙周袋,钢丝被埋于牙周袋内，钢丝结扎处牙龈增生明显。结扎6周，牙龈严重退缩，呈暗红色，质地松软，探针出血明显，根分叉暴露，有牙周溢脓倾向。

2.1.3 P3组 结扎1周，丝线无松动及脱落现象，周围有大量食物及软垢滞留，牙龈水肿、充血，质地松软，根分叉区暴露。结扎14d，牙龈退缩至根中1/3处，根分叉暴露，探针可探入根分叉区，但未与对侧贯通。结扎4周，丝线结扎处牙龈增生明显，根分叉完全暴露，与对侧形成贯通性病变。结扎6周，牙龈退缩，质地松软，根分叉暴露，有牙石形成。

2.1.4 P4组 大鼠少动，毛色亮且顺，左侧下颌下缘伤口处愈合良好，牙龈色形质基本正常，无明显炎症性改变。进食量及体重没有明显改变。

2.1.5 N组 大鼠活动正常，左侧伤口愈合良好，牙龈色形质正常，进食量及体重未见明显改变。

2.2 针刺实验结果 在术后不同时间段用大头针刺大鼠双侧下颌区域，左侧无逃避反应，右侧逃避反应明显。

2.3 X线检查

2.3.1 P1组 1周时，牙周膜间隙增宽，牙槽嵴顶高度降低，骨白线消失，根分叉区呈低密度透射影像。2周时，牙槽嵴顶位于根尖1/3处，边缘模糊，根分叉区呈透射影像。6周时，牙槽嵴顶位于根尖1/3处，边缘较清晰，牙周膜间隙明显增宽，根尖周呈透射影像。

2.3.2 P2组 2周时，牙槽嵴顶约位于根冠1/3处，边缘模糊，根分叉区呈完全透射影像。6周时，牙槽嵴顶位于根尖1/3处，牙周间隙增宽，边缘模糊不清。

2.3.3 P3组 1周时，牙周膜间隙增宽，牙槽嵴顶高度降低，骨白线消失，根分叉区呈低密度透射影像。2周时，牙槽嵴顶边缘模糊，根分叉区呈透射影像。6周时，牙槽嵴顶位于根中1/3处，边缘较清晰。

2.3.4 P4组 1周时，未有明显变化。2周时，牙周膜间隙增宽，宽度较均匀。骨白线不清晰，牙槽嵴顶位置未见明显异常。6周时，牙周间隙明显增宽，牙槽嵴顶模糊，高度降低，固有牙槽骨密度降低。

2.3.5 N组 1周时，牙周膜间隙宽度均匀一致；牙槽嵴顶位于釉牙本质界附近，根分叉区及牙槽间隔骨质密度未见异常。其他时间段X线下观察牙周组织情况与1周时相比未见明显异常(图1)。

2.4 组织病理切片观察

2.4.1 P1组 结扎1周，结缔组织内炎性细胞向根方弥漫浸润，结合上皮附着位点向根方延伸；牙周韧带纤维排列紊乱，出现断裂；牙槽骨高度明显降低，牙槽窝内壁出现大量破骨细胞及骨吸收陷窝。结扎2周，牙周胶原纤维破坏,出现断裂、疏松、变性，排列紊乱，牙周膜间隙增宽；骨吸收陷窝增多。结扎4周，牙周间隙不规则增宽，牙槽嵴顶形态不规则，有死骨形成。结扎6周，牙周纤维排列趋于正常，慢性炎性细胞浸润，骨吸收陷窝内破骨细胞数量减少(图2)。

2.4.2 P2组 结扎1周,牙龈上皮溃疡、糜烂，炎症细胞浸润。结扎2周，结合上皮增生,钉突向结缔组织深部延伸；结缔组织内炎症细胞弥漫,毛细血管扩张充血；胶原纤维破坏，排列紊乱。结扎4周，炎性细胞向根方弥漫浸润,结合上皮附着位点向根方延伸；牙周韧带纤维排列紊乱，出现断裂；牙槽窝内壁出现骨吸收陷窝及大量破骨细胞。结扎6周，牙周膜显著增宽，纤维排列紊乱，牙槽骨破坏严重，可见纤维性变(图3)。

2.4.3 P3组 结扎1周，牙周韧带纤维排列紊乱,牙槽骨内壁形态变得不规则。结扎2周，牙槽骨内可见较多的骨吸收陷窝及纤维样变。结扎6周，牙周纤维排列趋于正常，牙槽骨高度降低，慢性炎性细胞浸润(图3)。

2.4.4 P4组 各时间段，牙周组织无明显炎症反应。在实验4、6周，牙槽骨骨小梁变细且较稀疏，血管和淋巴管扩张，牙周间隙不规则增宽(图 4)。

2.4.5 N组 各时间段牙周组织无明显变化(图 5)。

3.讨论

牙周病是多因素所致的牙周组织慢性炎症性破坏性疾病，国内外大量研究证实神经因素与牙周炎的发生发展和牙周组织的再生修复密切相关[3-6]，Zavarella等[7]报道了1例因颅神经损伤导致同侧上下颌严重牙周病的病例，推测支配牙周组织的神经损伤和牙周病的发病密切相关，但其具体作用及机制尚不清楚。

图1 X线检查图片

图2 P1组2周时组织学观察

图3 P2组6周时组织学观察(HE，×4)

图4 P3组6周时组织学观察

实验表明，单纯离断神经组(P4组)随着失神经支配时间的延长，牙槽骨的密度和高度较假手术组(N组)有较明显的降低，前期研究也表明[8]，下牙槽神经缺失能明显加重牙周支持组织尤其是牙槽骨的破坏，但是单纯的神经缺失不会形成牙周炎。要深入研究神经因素在牙周病发生发展及牙周组织再生修复中的重要作用，需要有稳定可靠的动物模型。

图5 P4组、N组6周时组织学观察(HE，×4)

大鼠是一种较为常用的构建牙周炎模型的动物[9]，且大鼠的脑神经与人类相似，适合用于神经和精神性疾病的研究[10]。本实验采用Wistar雄性大鼠作为动物模型，避免怀孕等对实验的影响。

本实验采用了牙颈部结扎联合高糖软食的方法建立牙周炎动物模型。为了明确不同材质结扎丝对牙周炎的影响，对丝线和正畸用结扎丝的建模效果进行了比较。结果表明，结扎丝不同对牙周组织的刺激不同，相同材质结扎丝，离断下牙槽神经组较未离断神经组严重。丝线结扎组(P1组)出现的较钢丝结扎组(P2组)早且严重，建模效果好。究其原因，可能是丝线比结扎丝粗糙，吸水后体积有一定的膨胀，自洁作用差，相同喂养条件下，丝线比结扎丝更容易造成食物及菌斑滞留。程珏[11]等发现丝线结扎容易脱落，未能成功诱导出牙周炎模型。在本实验中未发现有丝线脱落的情况，可能与以下因素有关：(1)在结扎过程中，用15-30#K型根管锉适当扩大了邻间隙，采用这种方法不仅便于丝线结扎，还不会破坏邻接关系，减少了丝线脱落的几率。同时，在操作过程中对牙周组织形成机械刺激，有利于菌斑的附着和牙周炎症的形成。(2)术后采用软食和高糖饮水喂养，对丝线的磨损较小，而且高糖软食能更利于菌斑堆积，更快的形成牙周炎模型。

[1]孙 静，李 纾，高 艳，等.大鼠下牙槽神经离断和牙周炎双重动物实验模型的建立[J].上海口腔医学，2012，21(1):9-14

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[8]高 艳，孙 静，李 纾，等.离断下牙槽神经对大鼠牙周炎进展影响的组织学改变[J].滨州医学院学报，2011，34(6):422-426

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[11]程 珏，李 霞，孙克勤，等.不同方法构建大鼠实验性牙周炎模型的研究[J].中国药物与临床，2007，7(9):682-684