七厘散含药血清对乳鼠毛囊成纤维细胞增殖的影响＊

刘爱军 陈杏晔 广州中医药大学组胚教研室（广州510006）

△广州中医药大学2012级研究生（广州510006）

皮肤覆盖在人体表面，在日常生活中极易受到损伤，毛囊真皮的成纤维细胞（fibroblast）能分泌Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、FN（fibronectin）等ECM成分和碱性成纤维细胞生长因子（base fibroblast growth factor，bFGF）、血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等多种细胞因子，能促进各种生长因子的分泌，诱导皮肤表皮细胞的增殖和迁移，促进皮肤创面的完整修复。七厘散是著名的伤科常用中成药，本项目组前期研究证明七厘散能促进创面成纤维细胞分泌胶原纤维，促进新生毛细新生，修复表皮和毛囊，但中药促进皮肤愈合的作用机理并不清楚。本文通过探讨七厘散含药血清对分离培养的SD乳鼠触须部毛囊真皮根鞘细胞增殖的影响，为更加深入的研究中药促进细胞增殖和分化的分子机制；寻找切实、有效的药物作用靶点奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 出生3d的SD乳鼠（雌雄不拘），用于取触须部毛囊。雄性SD大鼠（质量180－200g），用于制备含药血清。以上实验动物均由广州中医药大学实验动物中心提供。

1.2 主要试剂与仪器 HG－DMEM培养（美国Gibco公司）；优质胎牛血清（FBS）（天津灏洋生物制品科技有限责任公司）；青霉素/链霉素（Hyclone公司）；0.01mmol/L PBS（Hyclone公司）；0.25%胰蛋白酶（美国Sigma公司）；倒置相差显微镜（日本Olympus）；RT－2100C酶标仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）；Ⅰ抗：层黏连蛋白（Laminin，LN）、纤黏连蛋白（Fibronectin，FN）、波形蛋白（Vimentin）（均购自武汉博士德试剂公司）；Ⅱ抗IgG、SABC－Cy3试剂盒（武汉博士德试剂公司）；核荧光标记物DAPI（美国Sigma公司）。中成药七厘散（批号：0100033，北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂）

1.3 方法

1.3.1 SD乳鼠毛囊真皮细胞的获取 将出生3d的同一胎次的、正常发育的SD乳鼠10只浸泡于75%酒精中，5min×3次。剪去带有完整触须部毛囊的皮肤，双抗D－Hank’s液洗1次，无双抗D－Hank’s液洗2次。超净工作台内分离出完整的触须毛囊，均匀置于T25培养瓶，添加少量10%FBS的HGDMEM培养基，37℃、5%CO2、饱和湿度条件下常规培养，24h后添加培养基，细胞长满后按1∶3进行传代。

1.3.2 细胞爬片的制作 将P2代细胞消化稀释成细胞悬液，按1×107/L接种于放有消毒盖玻片的24孔培养板中，每孔接种1mL，于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下常规培养，待细胞长满盖玻片50%左右时，取出盖玻片，0.01mmol/L PBS洗3次，中性甲醛固定30min，0.01mmol/L PBS洗3次。

1.3.3 免疫荧光显微镜检测 P3代毛囊真皮细胞爬片，免疫荧光检测LN、FN、Vimentin的表达（实验步骤按产品说明书进行），Ⅰ抗效价均为1∶100，Ⅱ抗效价1∶100，SABC－Cy3显色后，DAPI复染细胞核，荧光显微镜观察拍照。

1.3.4 七厘散含药血清的制备 七厘散灌胃液按0.15g/1.5mL配制，每天每只大鼠灌胃两次，间隔12h，灌胃量1.5mL/200g，连续灌胃，分别在3d、5d、7d腹主动脉血，每个时间点共灌胃5只大鼠，取血当日早晨再灌胃1次，间隔1h，麻醉大鼠，打开腹腔，负压管抽腹主动脉血。静置30min，3000r/min离心10min，吸取上层血清，将所得同一时间点的5只大鼠的血清混合，50℃灭活30min，0.2μm 滤膜过滤除菌，分装，－20℃保存备用。

1.3.5 MTT检测 七厘散含药血清对P3代毛囊真皮细胞增殖的影响 将P2代毛囊细胞制成细胞悬液，按3000个/孔种植入96孔板，24h后更换无血清DMEM培养基；24h后弃培养基，将细胞分成空白对照组、无血清组、0%含药血清组、2.5%含药血清组、5%含药血清组、10%含药血清组、20%含药血清组，FBS补足血清总体积百分比为20%，每组7个复孔，分别添加相应的药物100μL/孔；24h后弃培养基，加入0.5mg/mL MTT 100μL/孔；37℃、5%CO2条 件 下 放 置 4h，加 DMSO100μL/孔，震荡10min，紫外分光光度计检测。

1.4 统计学处理 定量数据用均数±标准差表示。应用SPSS13.0统计软件中单因素方差分析（one－way ANOVA）进行组间均数的比较，两两组间均数比较视方差齐性检验（以0.1作为检验水准进行Levene检验）结果，当方差齐同时，用LSD检验，当方差不齐时，用Tamhane’s T2检验。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 SD乳鼠毛囊细胞分离培养结果 种植后细胞很快贴壁，24h后可见贴壁细胞呈，可见从SD乳鼠毛囊有成纤维状细胞迁出（图1），3d细胞长满培养瓶约80%左右，进行传代，残留的毛囊及组织块随着传代和换液逐渐除去，细胞传至P3代时呈较纯化的成纤维状细胞（图2）。

2.2 SD乳鼠毛囊真皮细胞免疫荧光检测结果

分离培养的SD乳鼠毛囊真皮成纤维状细胞，免疫荧光检测FN（图3）、LN（图4）、Vimentin（图5）表达阳性。

2.3 MTT检测七厘散含药血清对P3代毛囊真皮细胞增殖的影响 七厘散灌胃后，3d、5d、7d含药血清对P3代毛囊真皮细胞24h增殖的作用趋势相同，均在含药血清5%组对细胞促增殖作用达到最大，并且促增殖作用优于普通的胎牛血清；之后随着含药血清体积百分比增加促增殖作用下降。3d和5d含药血清组的促增殖作用优于7d含药血清组。

表1 七厘散含药血清作用24h对SD乳鼠毛囊成纤维细胞增殖的影响

取3d、5d、7d含药血清组的数值分别进行单因素ANOVA分析，3d组F＝0.014，采用LSD法，发现不同体积分数含药血清组间有显著性差异（P＝0.03），3d含药血清组中5%含药血清组刺激细胞增殖效果最佳；5d组、7d组方差不齐（分别为F＝0242，F＝0.219），用Tamhane’s T2检验方法，空白组与其他组之间有显著性差异（P＜0.004），其它组间差异均无显著性意义（P＞0.05），可见3d组5%七厘散含药血清对细胞促增殖作用最好。

3 讨 论FSC是组织工程皮肤理想的种子细胞，但是毛囊干细胞的有效增殖和定向分化至今仍未解决［1－4］。毛囊真皮根鞘中的成纤维细胞能分泌Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、FN等ECM 成分和bFGF、VEGF、EGF等多种细胞因子［5，6］，能促进FSC分化为表皮细胞并促进毛囊的完整修复，因此深入研究毛囊真皮鞘成纤维细胞的生物学特性、利用其改善毛囊干细胞的增殖和定向分化能力具有重要意义。

七厘散是著名的伤科常用中成药，广泛应用于外科疮疡、烫伤、跌打损伤、金刃重伤等病症，疗效显著。本项目组前期研究证明七厘散作用于小鼠触须部去表皮创面，具有明显的抗炎、促修复作用。创面修复早期有大量炎细胞渗出、浸润；修复中期表皮细胞、成纤维细胞增殖明显，胶原纤维的合成和分泌增加；修复晚期真皮胶原纤维排列规则，新生毛细血管较多，创面表皮修复，毛囊重新形成，其疗效优于临床西药EGF，说明中药通过对创面微环境的改善，促进胶原纤维的合成和分泌，胶原纤维能有效促进表皮细胞的迁移和分化［7］，能促进表皮及毛囊的重新生成［8］。

本实验免疫荧光检测所分离培养的毛囊真皮细胞FN、LN、Vimentin表达阳性，说明所培养的细胞是成纤维细胞。七厘散灌胃后3d、5d、7d的含药血清按不同体积百分比作用于体外培养的毛囊真皮成纤维细胞24h，7d七厘散含药血清组较3d组和5d组促增殖作用较差。七厘散含药血清体积百分数5%促增殖效果最佳，SPSS统计软件分析发现，3d组和5d组优于7d组，且3d组和5d组之间差别无统计学意义，说明灌胃3d即为最佳的时间点。每组中均随着七厘散含药血清体积百分比增加，促毛囊真皮成纤维细胞增殖的作用增强，当七厘散含药血清体积百分数5%促增殖效果最佳，之后随着含药血清体积百分比增加，促增殖作用下降，说明七厘散对真皮成纤维细胞生长的调节是双向的，在创伤修复中以促增殖为主，当修复到一定程度，促增殖作用下降，防止胶原纤维过度堆积，形成瘢痕组织，充分体现了中药促进皮肤愈合的整体性和双向性调节［9，10］。

［1］Pontiggia L，Biedermann T，Meuli M，et al.Markers to evaluate the quality and self－renewing potential of engineered human skin substitutes in vitro and after transplantation［J］.J Invest Dermatol，2009，129（2）：480－490.

［2］Plikus MV，Mayer JA，de la Cruz D，et al.Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration［J］.Nature，2008，451（7176）：340－344.

［3］Qi SH，Liu P，Xie JL，et al.Experimental study on repairing of nude mice skin defects with composite skin consisting of xenogeneic dermis and epidermal stem cells and hair follicle dermal papilla cells［J］.Burns，2008，34（3）：385－392.

［4］朱堂友，郝 飞，伍津津，等.人毛囊细胞来源双层皮肤替代物的构建和组织学特征［J］.第三军医大学学报，2007，29（12）：1187－1189.

［5］Charruyer A，Ghadially R.Stem cells and tissue－engineered skin［J］.Skin Pharmacol Physiol，2009，22（2）：55－62.

［6］Metcalfe AD，Ferguson MW.Bioengineering skin using mechanisms of regeneration and repair［J］.Biomaterials，2007，28（34）：5100－5113.

［7］刘爱军，易 华，杜标炎.龙血竭对小鼠触须部毛囊干细胞增殖和分化的影响［J］.陕西中医，2011，32（8）：1089－1092.

［8］刘爱军，易 华，杜标炎.七厘散促小鼠触须部创面修复及部分机制探讨［J］.陕西中医，2012，33（4）：490－492.

［9］吴江群，聂兴举，秦泽莲.氧化苦参碱对病理性瘢痕成纤维细胞增殖凋亡的影响［J］.中国微创外科杂志，2011，11（3）：259－263.

［10］李凤玉，贾国洪，万 立，等.脂多糖对增生性瘢痕患者正常皮肤成纤维细胞增殖及Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA和胶原酶 mRNA表达的影响［J］.临床医学工程，2011，18（2）：161－164.