EGFR和C-erB-2在肺腺癌淋巴结转移中的意义

林少欢 吕俊宏 彭盘俐 蔡长青 吴政光

1.广东省第二人民医院心胸外科 （广东 广州 510317）

2.广东省第二人民医院肿瘤二科 （广东 广州 510317）

3.广东省第二人民医院放射科 （广东 广州 510317）

肺腺癌是一种常见的恶性肿瘤，由于肺腺癌的高发病率、恶性行为以及缺少有效的治疗方法，导致肺腺癌已经成为肺癌中主要死因。近年肺腺癌患者的整体预后仍不满意，多数患者在诊断时已经发生转移。侵袭和转移已经是肺腺癌患者致死的主要原因之一，因此，研究肺腺癌转移对其治疗很有现实意义。近年来研究显示，很多肿瘤类型中可检测到EGFR，C-erB-2的过度表达[1,2,3]，它们的失调表达与肿瘤的发生、发展有着密切关系。近期我们采用免疫组化法检测了肺腺癌组织中EGFR、C-erB-2蛋白的表达情况及关联性，探讨EGFR、C-erB-2蛋白表达与肺腺癌的淋巴结转移关系。

1 材料与方法

1.1 材料 观察组为67份肺癌组织标本，取自心胸外科肺癌手术标本，均经广东省第二人民医院病理科诊断证实。其中患者男35例，女32例；年龄42～73岁，平均63.7岁。其中有淋巴结转移38例，无转移29例。同时收集30份良性肺疾病组织标本为对照组，也均取自心胸外科肺部手术标本，均经广东省第二人民医院病理科诊断证实，其中肺大疱组织标本17份，肺结核组织标本13份。

1.2 EGFR、C-erB-2、E-cadherin蛋白表达检测 用已知阳性表达组织作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照，采用SP法(试剂盒购于中国中杉金桥)对两组标本进行染色。具体步骤如下：石蜡标本行4μm厚连续切片，脱蜡，对切片进行预处理。3%过氧化氢去离子水孵育10min，阻断内源性过氧化物酶。PBS冲洗，2min×3次。滴加一抗(鼠抗人EGFR、C-erB-2单克隆抗体购于美国Santa Cruz)，4℃湿盒过夜。PBS冲洗3次，2min×3次。滴加PV-9000工作液，37℃湿盒内孵育30min，PBS冲洗，2min×3次。选用DAB显色(试剂盒购于中国中杉金桥)，自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。DAB显色法示阳性染色为棕黄色颗粒染色结果，根据细胞膜着色的阳性细胞百分率和阳性染色程度评价。每张切片随机观察5个高倍视野(400×)，计算每个视野(约100个肿瘤细胞)中染色阳性细胞数，着色细胞占计数细胞百分率小于25%为(-)；25～50%为(+)；50%～75%为(++)；大于并等于75%为(+++)[4]。

1.3 EGFR、C-erB-2基因表达检查 引物设计参照Genbank mRNA序列，使用Primer Premier 5.0设计，由上海生工生物有限公司合成。EGFR上游引物：5’-atggaataccctgggtgt-3’；下游引物：5 ’-ggacaagctggtcaaggt-3’；C-erB-2上游引物：5’-gatgtatttgatggtgacct-3’，下游引物: 5’-atctggctggttcacatatt-3’。对照GAPDH上游物：5’-gctctcttccaaccttcctt-3’，下游引物：5’-tggaaggtffacagcgaggc-3’；按照Ambion1861全RNA提取试剂盒说明书提取细胞全RNA。按照Fermentus RT-PCR试剂盒说明书配置20ul PCR反应体系，以GAPDH作为内参。得出实验组CT值和内参CT值(CTOAPDH)，将CT目标基因减去CTgapdh获得△CT，用为公式计算各组相对表达量，并比较各组间目标基因的mRNA表达量，实验重复3次，采用均数标准差表示。

1.4 统计学方法 率的比较采用χ2检验，二分类资料的关联性分析用spearman等级相关分析，统计分析应用SPSS 13.0软件包。

2 结 果

2.1 EGFR、C-erB-2、E-cadherin 蛋白在肺腺癌组织与肺良性病变组织的表达观察组与对照组 EGFR蛋白阳性率表达分别为(p=0.001)；C-erB-2蛋白表达阳性率分别为(p=0.002)；E-cadherin蛋白表达阳性率分别为(p=0.001)。

表1 EGFR、C-erB-2、E-cadherin 蛋白在肺腺癌组织与肺良性病变组织表达

表2 EGFR、C-erB-2 蛋白表达与肺腺癌淋巴结转移的关系

表3 EGFR、C-erB-2 蛋白表达的关联性分析

表4 EGFR、E-cadherin蛋白表达的关联性分析

表5 C-erB-2、E-cadherin蛋白表达的关联性分析

如表2，图1-4所示转移组的EGFR蛋白表达量较非转移组高(p=0.001)，转移组的C-erB-2蛋白表达量较非转移组高(p=0.001)，相反，转移组的E-cadherin蛋白表达量较非转移组高(p=0.002)，如表2。

2.2 EGFR、C-erB-2、E-cadherin 蛋白在肺腺癌组织表达的关联性 EGFR与C-erB-2呈正相关(r=0.425，p=0.001)，EGFR与E-cadherin呈负相关(r=-0.510，p=0.0001)，(r=-0.301，p=0.001)，具有统计学意义(p＜0.01)。详见表2、3、4。

2.3 EGFR、C-erB-2 mRNA表达情况 如图5所示两组实验组的EGFR、C-erB-2 mRNA表达量较对照组均高，且转移组较非转移组高。如图6所示两组实验组的EGFR mRNA相对表达量较对照组均高(p=0.001，p=0.001)，且转移组较非转移组高(p=0.001)。如图7所示两组实验组的C-erB-2 mRNA相对表达量较对照组均高(p=0.001，p=0.001)，且转移组较非转移组高(p=0.001)。

3 讨 论

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一种跨膜粘蛋白，当特定配体与其结合后可导致细胞内一系列的级联生化反应激活。目前诸多研究发现，EGFR过度表达可诱导和激发多种类型癌细胞转移[5]。事实上，其他一些证据也表明EGFR过度表达或浓度在肺腺癌的侵袭性及转移方面起着至关重要的作用[6-9]。但目前EGFR与肺癌淋巴转移之间的关系目前尚未完全明确。

大多数研究结果均显示：EGFR细胞信号转导通路的激活涉及癌细胞转移过程与EGFR细胞信号转导通路的激活相关联[10-12]。而且这些研究发现，EGFR相关基因的突变更多的发生在非小细胞肺癌，而在其他类型肿瘤中则相对少的发生。EGFR过度表达可能会引起细胞的分化出现异常，导致细胞间黏附因子表达缺失，进一步引起细胞间黏附力下降，导致肿瘤容易发生淋巴转移和远处转移[13]。而E-钙黏蛋白(E-cadherin)是一种钙依赖性跨膜蛋白，其表达降低或缺失会使肿瘤细胞间的黏附减弱，易于脱落和迁移，导致肿瘤侵袭和转移[14-15]。本实验发现，EGFR的阳性表达率在有淋巴转移组明显高于无淋巴转移组。有趣的是，其表达与E-cadherin的表达呈负相关，这些研究结果提示EGFR的过度表达可能和肺腺癌的淋巴转移有关，进一步推测，EGFR的过度表达致使E-cadherin表达下调，导致肿瘤细胞脱落和迁移，终致淋巴结转移。同时实验组推测，EGFR还可能是通过与其他相关因子的相互作用而促进肺癌的淋巴转移。从而让我们想到，与EGFR同属于ErbB 受体家族的C-erB-2蛋白。

C-erB-2是一种原癌基因，它编码的产物为C-erB-2蛋白，也是一种跨膜蛋白受体，又被称为ErbB-2。它与EGFR同属于ErbB受体家族，在结构上和EGFR高度同源，同样具有酪氨酸蛋白激酶活性，与相应的配体结合后同样激活信号转导通路，引起胞内级联反应，导致细胞增殖，参与肿瘤的侵袭、转移。有研究表明[11,15-18]，虽然两者结构同源，但是EGFR的配体却不能与C-erB-2蛋白结合，同时两者有着密切的关系，通过以上2种方式激活胞内的酪氨酸激酶,启动下游信号转导,促使细胞转移。目前已证明多种肿瘤发生与二者过度表达有关，并与肿瘤生物学性状具有相关性。我们研究结果显示：在肺腺癌组织中EGFR、C-erbB-2表达水平明显高于良性肺组织组，分析还提示肺腺癌中两者蛋白水平表达一致符合率，具有正相关，与组织病理学分级亦呈正相关，说明EGFR、C-erbB-2参与肺腺癌淋巴结转移有关。无独有偶，C-erB-2与E-cadherin表达之间具有负相关性，由此推测EGFR和C-erB-2基因被激活后可能通过特定的调控机制及信号转导通路促进肺癌的淋巴转移，并进一步下调E-cadherin表达，最终出现肿瘤侵袭、转移。由此两者可作为判断人肺腺癌的进展情况的指标之一。

总之，EGFR和C-erB-2与肺腺癌的淋巴结转移有着密切的关系，可能2种方式激活胞内的酪氨酸激酶，启动下游信号转导，协同促使细胞转移，且二者的相互作用能进一步抑制E-cadherin的表达，最终致使肿瘤淋巴结转移，但具体机制尚需进一步研究。如果阻断这一信号途径，将会为肺癌的治疗开辟新的途径。

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