复合诱变选育高产虾青素的红法夫酵母菌株*

胡向东，潘玲燕，章祺，叶茂，梁新乐

1(浙江皇冠科技有限公司，浙江 杭州，310012)

2(浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江杭州，310018)

虾青素(astaxanthin)为 3，3-二羟基-4，4-二酮基-β，β-胡萝卜素，是一种酮式类胡萝卜素，为艳丽红色，具脂溶性，广泛应用于水产养殖，可使水产动物呈现鲜艳的颜色，以更具观赏性［1］;另外虾青素具有极强的生物抗氧化性、促进机体抗体产生、增强免疫力以及抗紫外线辐射等作用［2］。因而在食品添加剂、水产养殖、化妆品、保健品和医药工业方面有广阔的应用前景［3－6］。

红法夫酵母作为虾青素的主要生物来源之一，具有能利用多种糖类进行异养代谢、生长速度快、培养时间短、不需要光照、能够在发酵罐中高密度培养等优点［7］。但野生型红法夫酵母因其虾青素产量低，每克干酵母仅产生约500 μg类胡萝卜素，而产虾青素仅为350 μg，无法满足市场需求，为提高其虾青素产量，一个重要的方法是进行诱变育种。UV诱变是常用的物理诱变方法，但是单纯的紫外诱变效果不理想，因此国内外学者对此进行了大量研究，采用UV-亚硝基胍 (NTG)协同诱变［8］、LiCl-UV和NTG复合诱变［9］、UV-NTG 和60Co-γ 射线复合诱变［10］等诱变方法对红法夫酵母菌株进行诱变，提高虾青素的产量。本文首先对红法夫酵母菌株进行UV-LiCl复合诱变处理以筛选高产菌株，再对其用60Co-γ射线诱变处理，筛选若干高产菌株后再进行一轮UV-LiCl复合诱变和60Co-γ射线诱变处理，从而选育出高产虾青素且具有稳定性遗传的酵母菌株，命名为HSC-125。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

亲本菌株为红法夫酵母(P.rhodozyma)02，由浙江工商大学食品与生物工程学院保藏，由梁新乐(浙江杭州)赠送，于－80℃下保存于含有30%的甘油内。

1.1.2 培养基

YM培养基(g/L):10.0葡萄糖，5.0缩酵母浸出粉，5.0蛋白胨，pH 5.4。若为固体培养基需加入2.5%琼脂粉。

YM-二苯胺选择性培养基:待YM培养基冷却至50℃时加入一定量的无菌二苯胺溶液。

摇瓶发酵培养基(g/L):20.0葡萄糖，5.0蛋白胨，5.0 浓缩酵母浸出粉，3.0(NH4)2SO4，0.5 MgSO4·7H2O，1.5 KH2PO4，0.1 CaCl2·2H2O，pH 5.4。

1.2 培养及分析方法

1.2.1 菌种活化

从－80℃保藏的菌悬液或YM斜面上取1环至装有30 mL新鲜YM液体培养基的250 mL锥形瓶中。22℃、220 r/min培养36～48 h后，稀释10－6涂布于YM平板，置于22℃培养箱培养3～5 d。挑取颜色深红且较大菌落于斜面，置于22℃培养3～5 d。

1.2.2 种子培养

挑取斜面上的活化菌至装有30 mL种子培养基的250 mL锥形瓶，置于22℃、220 r/min的恒温摇床，培养36～48 h。

1.2.3 摇瓶发酵培养

取种子培养液，按10%(v/v)接种量接入装有30 mL液体发酵培养基的250 mL锥形瓶中，置于22℃、220 r/min的恒温摇床，培养72 h。

1.2.4 虾青素含量的测定

采用紫外分光光度测定法［11］。取5 mL发酵液于5 000 r/min下离心10 min，去离子水洗涤2次，收集菌体，加入1 mL 55℃预热的二甲亚砜 (DMSO)，振荡悬浮，加入丙酮4 mL，漩涡振荡20～30 s，最后4℃，5 000 r/min离心10 min，上清液用分光光度计测OD474。如菌泥仍有色可重复抽提至白色为止，虾青素含量计算:

式中:A，OD474mm值;V1，有机溶剂的总体积，mL;2 150，比消光系数;V2，发酵液体积，mL;100，单位换算后的作数，mg/L。

1.2.5 菌体生物量的测定

取5 mL菌悬液，5 000 r/min离心10 min，弃上清液，菌体用去离子水洗2次，在烘箱中于105℃烘至恒重，然后称重。

1.3 诱变方法

1.3.1 二苯胺抗性浓度的确定

将对数期的出发菌株P.rhodozyma 02菌液用无菌生理盐水稀释不同梯度浓度:106、105、104、103、102/mL，分别取3 μL菌悬液点样到含二苯胺(二苯胺浓度分别为 0、10、20、40、60、80、100 μmol/L)的抗性平板。22℃培养5～7 d，观察不同平板上菌落的生长情况及菌落颜色变化，颜色由红到浅黄直到无色，即为二苯胺对该菌的最小抑制浓度(MIC)。

1.3.2 UV-LiCl复合诱变育种

将对数期的出发菌株菌液用无菌生理盐水稀释到106/mL，然后各取5 mL菌悬液于带磁力转子的培养皿中，各加入300 μL 10%LiCl混匀后开盖进行紫外线照射。在30 cm，15 W 下紫外线光照1、3、5、7、9、12、15、20 min。将经过不同时间照射后的菌液黑暗处理稀释10－3倍，涂布于已确定的二苯胺最适浓度平板上，在22℃恒温培养箱中暗培养5～7 d。以未经诱变的菌悬液同样操作作为对照，计算致死率。从平板上筛选颜色较红，菌落较大的菌株进行摇瓶复筛，检测各菌株生物量和虾青素产量，筛选较好的菌株进行60Co-γ射线诱变育种。

1.3.360Co-γ射线诱变育种

将UV-LiCl复合诱变筛选到的高产菌株培养至对数期，菌悬液浓度稀释至106/mL，进行60Co-γ射线处理，照射剂量为 2、3、3.5、4、4.5、5 kGy。辐射处理由浙江省农科院辐照中心进行。将照射后的菌液稀释，涂布于二苯胺抗性平板，22℃培养5～7 d。观察菌落生长情况，同时以未经诱变的菌悬液同样操作作为对照，计算致死率。从平板上筛选颜色较红，菌落较大的菌株进行摇瓶复筛，检测各菌株生物量和虾青素产量，筛选虾青素高产菌株。

1.3.4 第二轮复合诱变

筛选出经60Co-γ射线诱变后高产虾青素的菌株，在最佳紫外光照射时间和最佳60Co-γ射线诱变剂量下进行下一轮复合诱变，其余步骤同“1.3.2和1.3.3”。

1.4 菌株稳定性测试

筛选出经两轮UV-LiCl诱变和60Co-γ射线诱变育种后的高产虾青素菌株，对其进行稳定性试验，传代5次，分别测定其生物量和虾青素产量，验证菌株遗传稳定性。

2 结果与分析

2.1 二苯胺筛选剂量的选择

在进行诱变育种前，将不同浓度的抗性筛选剂二苯胺添加到YM固体培养基内，诱变后，当抑制剂去除，突变型菌株所合成的虾青素含量往往比野生型高，利用这一原理筛选出虾青素含量较高的突变株。如图1，出发菌株P.rhodozyma 02随着二苯胺浓度的增加颜色逐渐变淡，出发菌株在40 μmol/L的抗性平板上颜色发白，达到了通过颜色即可区分高低产菌株的效果，因此本实验选择MIC为40 μmol/L做为抑制剂的筛选浓度。

图1 红法夫酵母菌株在不同浓度二苯胺平板上的生长情况Fig.1 Growth of P.rhodozyma 02 strains on YM agar medium with different concentrations of diphenylamine

2.2 UV-LiCl复合诱变育种结果

2.2.1 UV-LiCl复合诱变剂量的确定

LiCl是一种碱金属卤化剂，本身并无诱变作用，但与紫外线复合，克服了单纯用紫外线诱变效果不理想的弊端，且在一定浓度范围内，有利于菌体正突变的发生［12］。因此，本实验将原始红法夫酵母菌株进行UV-LiCl协同诱变，稀释后涂布于含有40 μmol/L二苯胺的YM平板上培养后，计算得到的致死率和正突变率如图2。随着照射时间的延长，红法夫酵母致死率增大，当照射20 min时，红法夫酵母几乎完全致死。按照诱变剂量选择的一般原则，选取菌体致死率大约在80%～95%之间的诱变剂量进行诱变［13］，位于此区间的诱变时间是5～12 min。而当诱变时间为7 min时，正突变率达到最大，为25.64%。因此，本实验选定紫外线照射时间7 min作为红法夫酵母菌株UV-LiCl协同诱变的诱变剂量。

图2 不同剂量UV-LiCl处理对红法夫酵母菌株的影响Fig.2 Dose response curves of P.rhodozyma 02 strains by UV-LiCl radiation

2.2.2 UV-LiCl复合诱变高产菌株的筛选

P.rhodozyma 02菌株经紫外照射7 min后，平板初筛63个单菌落，选取其中菌落大、颜色亮而红的菌株12株进行摇瓶发酵复筛，测定虾青素含量和生物量。结果见表1。从表1中可以看出，突变株H1－2、H1－12虾青素体积产量较高，分别是(9.62±0.16)mg/L和(9.44±0.14)mg/L，分别是出发菌株 P.rhodozyma 02的2.02和1.99倍。因此将H1－2、H1－12作为下一步60Co-γ射线诱变的出发菌株。

2.3 60Co-γ射线诱变育种结果

2.3.160Co-γ射线复合诱变剂量的确定

从UV-LiCl诱变结果中得到H1－2、H1－12两株虾青素产量较高的突变株，分别取其对数期菌悬液，稀释成浓度为106/mL，将其混合后进行不同剂量的60Co-γ射线照射，平板培养后计算得到致死率和正突变率。如图3，随着诱变剂量的增加，红法夫酵母致死率增大，红法夫酵母正突变率先增大后降低。当诱变剂量为3.5 kGy时，致死率为84.95%，正突变率达到最大为32.4%，当诱变剂量高于3.5 kGy时，致死率达到90%左右，正突变率低于24.36%;当诱变剂量低于3.5 kGy时，致死率低于80%正突变率低于20.86%。因此选择3.5 kGy为最适诱变剂量。

表1 UV-LiCl复合诱变突变株的生物量和虾青素产量Table 1 Biomass and astaxanthin production of mutants by UV-LiCl radiation

图3 不同剂量60Co-γ射线诱变处理对红法夫酵母突变株的影响Fig.3 Dose response curves of mutants by60Co-γ radiation

2.3.260Co-γ射线诱变高产菌株的筛选

H1－2、H1－12 突变株经3.5 kGy剂量的60Co-γ射线诱变后，平板初筛得到52个单菌落，选取其中菌落大、颜色亮而红的菌株12株进行摇瓶发酵复筛，测定虾青素含量和生物量。结果见表2。从表2中可以看出，突变株H2－5和H2－10的虾青素产量分别是(13.27±0.17)mg/L和(13.75±0.08)mg/L，分别是出发菌株H1－2的1.38和1.43倍。因此将H2－5和H2－10作为第2轮UV-LiCl复合诱变的出发菌株。

表2 60Co-γ射线诱变突变株的生物量和虾青素产量Table 2 Biomass and astaxanthin production of mutants by60Co-γ radiation

2.4 第2轮UV-LiCl复合诱变育种结果

将60Co-γ射线诱变育种筛选到的H2－5和H2－10菌株作为第2轮UV-LiCl复合诱变育种的出发菌株，UV照射处理时间7 min。平板初筛得到56个单菌落，选取其中菌落大、颜色亮而红的菌株10株进行摇瓶发酵复筛，测定虾青素含量和生物量。结果见表3。从表3中可以看出，突变株H3－3和H3－10的虾青素产量分别是(18.59±0.07)mg/L和(18.40±0.10)mg/L，分别是出发菌株 H2－10的1.35和1.34倍。因此将突变株H3－3和H3－10作为第2轮60Co-γ射线诱变的出发菌株。

表3 第2轮UV-LiCl复合诱变突变株的生物量和虾青素产量Table 3 Biomass and astaxanthin production of mutants by the second-round UV-LiCl radiation

2.5 第2轮60Co-γ射线诱变育种结果

将第2轮UV-LiCl复合诱变育种筛选到的H3－3和H3－10菌株作为第2轮60Co-γ射线诱变育种的出发菌株，诱变剂量为3.5 kGy。平板初筛得到50个单菌落，选取其中菌落大、颜色亮而红的菌株10株进行摇瓶发酵复筛，测定虾青素含量和生物量。结果见表4。从表4看出，突变株H4－2和H4－4的虾青素产量分别是(25.27±0.08)mg/L和(25.52±0.12)mg/L，分别是出发菌株H3－3的1.36和1.37倍。

表4 第2轮60Co-γ射线诱变突变株的生物量和虾青素产量Table 4 Biomass and astaxanthin production of mutants by the second-round60Co-γ radiation

2.6 菌株稳定性试验结果

将2轮复合诱变得到的2株虾青素产量较高的突变株H4－2和H4－4，进行摇瓶稳定性遗传试验，考察菌株传代稳定性，结果见表5。传代5次后，发现菌株H4－4具有良好的稳定性，而菌株H4－2稳定性较差。其中H4－4菌株虾青素体积产量达到25.36 mg/L，是原始出发菌株 P.rhodozyma 02的5.34倍。而H4－2菌株虾青素细胞产量最高达到25.27 mg/L，最低达到23.34 mg/L。所以最终得到1株稳定的高产虾青素红法夫酵母菌株H4－4菌株。

3 讨论

传统的物理诱变剂(紫外诱变、γ射线诱变等)比化学诱变剂，如NTG、甲基磺酸乙酯(EMS)、硫酸二乙酯(DES)毒性更弱。但是紫外线诱变虽然常见但是正突变率低，诱变菌株不稳定容易回复突变，γ射线易在水中产生氧自由基进而导致微生物发生基因重组，基于这个原因γ射线常用来改良菌株［14］。

本试验选择UV-LiCl和60Co-γ两种物理诱变剂对红法夫酵母菌株进行复合诱变。UV-LiCl诱变已成功应用于红法夫酵母菌株，提高虾青素产率［12］。利用60Co-γ射线成功改良菌种的报道也很多［15－16］，其正突变率较高，不易发生回复突变，操作简便。

表5 红法夫酵母突变株稳定性遗传试验结果Table 5 Inheritance stability tests of P.rhodozyma mutants

复合诱变通常包括3类:1是同一种诱变剂重复使用;2是两种或多种诱变剂先后使用;3是两种或多种诱变剂同时使用［17］。遵循上述原则可以有效提高诱变的效率，还能大幅度减轻工作量。本文采用两种诱变剂先后使用，进行2轮UV-LiCl复合诱变和2轮60Co-γ诱变，最终诱变得到两株高产虾青素的红法夫酵母菌株H4－2和H4－4。经稳定性试验考察，H4－4菌株遗传稳定性良好，虾青素产量为25.36 mg/L，是原始出发菌株5.34倍。本实验将最终得到的H4－4菌株命名为HSC－125，保藏编号为 CGMCC No.2024。

由此可见，对于筛选高产虾青素红法夫酵母突变株，采用多轮UV-LiCl和60Co-γ射线复合诱变结合二苯胺作为抗性筛选剂展现良好效果，并且高产菌株遗传稳定性良好。

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