酶解机械预处理啤酒糟制备饲用蛋白肽*

张麟，蔡国林，高献礼，陆健，董建军，余俊红，杨梅

1(啤酒生物发酵工程国家重点实验室，山东 青岛，266000)

2(江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡，214122)

啤酒糟(Brewer’s Spent Grain，BSG)是啤酒酿造过程中产生的副产品，粗蛋白含量在25%左右［1］，是一种潜在的蛋白饲料原料。然而，BSG的蛋白品质不佳，跟豆粕和鱼粉等相比，多肽含量较少，蛋白质的消化、吸收率较低，赖氨酸和蛋氨酸等必需氨基酸比较缺乏［2－4］，同时啤酒糟中的蛋白类物质被纤维木质素类物质包裹，不易被释到细胞外，更加难以被生物利用，这些缺陷导致其饲用品质不高，价值较低。

对啤酒糟进行机械预处理，可以使蛋白类物质释放到胞外，更利于蛋白质与酶接触，使得饲料更易受消化酶作用［5］。对啤酒糟进行液态酶解，获得蛋白肽，可以避免大分子蛋白对动物的致敏性，且小分子蛋白更容易被动物消化、吸收，同时具有促进免疫，调节激素的功能［6］。卢虹［7］等人用中性蛋白酶酶解未经机械预处理的啤酒糟，由于啤酒糟样品细胞壁结构的复杂性，导致产品的蛋白质含量低，酶解后得到的水溶性蛋白、多肽含量同样较低。而彭元怀［8］等人利用鱼粉制备饲用蛋白肽的成本较高，并且成品带有腥味，不适合大规模的应用。

本研究通过机械方法对啤酒糟进行预处理，并对机械预处理过后的啤酒糟进行液态酶解，研究机械预处理和液态酶解对制备饲料蛋白肽的影响，同时对液态酶解的条件进行均匀设计优化，考察加酶量、温度、pH和酶解时间对啤酒糟酶解效率的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

啤酒糟由青岛啤酒上海松江有限公司提供。

1.1.2 实验所用主要试剂

NaOH、H2SO4、K2SO4、CuSO4、甲基红、溴甲酚绿等均为国药集团药品，中性蛋白酶(MAXAZYME NNP DS)由帝斯曼(中国)有限公司提供。

1.1.3 仪器与设备

DT260半自动凯氏定氮仪，福斯赛诺(苏州)分析仪器有限公司;DT208消化炉，福斯赛诺(苏州)分析仪器有限公司;UV-2100紫外分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司;Q-150A3刀片粉碎机，上海冰都电器有限公司;HH-4数显恒温水浴锅，江苏金坛荣华仪器制造有限公司;XQM-2L实验行星球磨机，长沙天创粉末技术有限公司;PL2002/EL204电子天平，METTLER TOLEDO(上海)有限公司。

1.2 啤酒糟的预处理

含水量为60%左右的啤酒糟经过60℃干燥成为啤酒糟原样。机械预处理方式为200 g样品经刀片粉碎5 min。

啤酒糟粉碎分级和球磨:经过刀片粉碎的啤酒糟用60目筛筛分，获得能通过60目筛的筛下物。筛下物进行球磨，得到筛下物球磨样品。

1.3 酶活测定

中性蛋白酶酶活测定:于40℃、pH 7.2的条件下，1 min水解酪素产生1 μg酪氨酸的酶量称为1个酶活力单位(U)［9］。

1.4 粗蛋白含量

粗蛋白含量的测定:凯氏定氮法［10］。

1.5 水溶性蛋白含量和多肽含量测定

水溶性蛋白含量测定:凯氏定氮法［11］。

多肽含量测定:按照参考文献进行测定［12］。

1.6 酶解条件优化

1.6.1 单因素试验

啤酒糟2 g，加入酶液10 mL，在初始条件:加酶量1 800 U/g，酶解温度40℃，pH 7.2，酶解时间1 h下进行酶解。

主要研究温度、pH、加酶量和酶解时间对啤酒糟水溶性蛋白含量的影响。

1.6.2 均匀设计实验

选取4个单因素进行5水平，N=10的DPS设计，每组试验重复进行3次，以水溶性蛋白含量为响应值，用DPS软件对试验结果进行二次多项式逐步回归分析，以考察各因素交互作用和最适条件。

1.7 饲用蛋白肽的制备

对酶解液进行真空冷冻干燥，干燥后粉碎即为饲用蛋白肽。

2 结果与讨论

2.1 机械预处理对啤酒糟粗蛋白和水溶性蛋白含量的影响

对啤酒糟进行刀片粉碎过筛，筛下物球磨之后，粗蛋白含量和水溶性蛋白含量的变化如图1所示。

图1 机械预处理对啤酒糟粗蛋白和水溶性蛋白含量的影响Fig.1 Effect of mechanical pretreatment on BSG crude protein content and soluble protein content

经过机械预处理后，筛下物球磨啤酒糟粗蛋白含量上升到38.8%，比原样中粗蛋白含量提高了36.1%。筛下物球磨啤酒糟水溶性蛋白含量上升到2.53%，比原样中水溶性蛋白含量提高了3.1倍。原因是蛋白类的物质结合力不如纤维类物质紧密，在粉碎处理过程中与纤维类物质的附着发生分离，并且由于蛋白类物质的粒径较纤维类物质要细小，在筛分过程中与纤维类物质分离，造成了筛下啤酒糟粗蛋白含量比啤酒糟原样粗蛋白含量高。

水溶性蛋白含量提高的原因可能是经过机械预处理后，原来啤酒糟中的细胞结构被破坏，其中的蛋白类物质释放到胞外，同时之前和纤维木质素类物质结合的蛋白类物质，在处理过程中也与纤维木质素类物质分离，这两种因素综合起来，导致机械预处理后的筛下物球磨啤酒糟水溶性蛋白含量显著提高。综上所述，机械预处理对啤酒糟中的粗蛋白含量和水溶性蛋白含量变化有着显著影响。

对筛下物啤酒糟和啤酒糟原样进行中性蛋白酶的液态酶解，酶解后水溶性蛋白含量如图2所示。两个样品经过液态酶解之后，水溶性蛋白含量提高明显，筛下物球磨啤酒糟水溶性蛋白含量达到12.85%，比原样的7.88%提高了1.6倍，说明机械预处理能够有效提高酶解效率。

图2 酶解对啤酒糟粗蛋白和水溶性蛋白含量的影响Fig.2 Effect of enzyme hydrolysis on BSG crude protein content and soluble protein content

2.2 筛下物球磨啤酒糟酶解条件优化

啤酒糟经刀片粉碎筛分后再球磨，可以大幅度降低啤酒糟中各聚合物的交联和取代，而这些聚合物往往会和酶通过非特异性结合，影响酶的活力。同时，粉碎和球磨处理可以降低啤酒糟的粒径和纤维素的结晶度［12］，粒径的降低使酶接触的有效表面积增加，酶与木质纤维素之间的非特异性结合减少，酶解效率大大提高。

2.2.1 加酶量对啤酒糟水溶性蛋白含量变化的影响

由图3可知，随着中性蛋白酶用量的增加，水溶性蛋白含量也随之增加。在酶添加量达到2 400 U/g时，进一步提高加酶量，水溶性蛋白含量不再明显提高。这是由于酶量的增大，酶与底物接触的机会增加，从而促进了酶解的进行，但是底物分子的有效酶作用位点是有限的，当酶与底物的有效接触达到饱和状态时，酶量的增加将不再引起水溶性蛋白含量的增加。超过2 400 U/g的加酶量，酶成本的投入增加，但是水溶性蛋白含量没有明显提升，考虑到成本等因素，故选择2 400 U/g为酶解时的加酶量。

图3 加酶量对啤酒糟水溶性蛋白含量的影响Fig.3 Effect of enzyme dosage on BSG soluble protein content

2.2.2 温度对啤酒糟水溶性蛋白含量变化的影响

调节酶解温度分别为35、40、45、50和55℃，考察酶解温度对水溶性蛋白含量变化的影响。由图4可知，筛下物球磨啤酒糟经中性蛋白酶酶解，随着温度的升高，水溶性蛋白含量逐渐增高，在45℃达到最大值16.2%。当温度高于45℃时，水溶性蛋白含量开始降低。温度对酶促反应速率的影响表现在两个方面，一方面是当温度升高时，与一般化学反应一样，反应速率加快;另一方面由于酶是蛋白质，当温度继续上升时，使酶蛋白逐渐变性而失活，引起酶反应速率下降。酶所表现的最适温度是这两种影响的综合结果。在酶反应的初始阶段，酶蛋白的变性尚未表现出来，因此反应速率随温度升高而增加，但高于最适温度时，酶蛋白变性逐渐突出，反应速率随温度升高的效应将逐渐为酶蛋白变性效应所抵消，反应速率下降，因此表现出最适温度。故选择45℃为酶解时温度。

2.2.3 pH对啤酒糟水溶性蛋白含量变化的影响

在上述酶解条件下，调节缓冲液pH，考察不同pH对水溶性蛋白含量变化的影响。由图5可知，筛下物球磨啤酒糟经中性蛋白酶酶解，随pH升高，水溶性蛋白含量升高，当pH达到8.0时，水溶性蛋白含量达到最大值17.8%，继续提高酶解pH，水溶性蛋白含量下降。

图4 温度对啤酒糟水溶性蛋白含量的影响Fig.4 Effect of temperature on BSG soluble protein content

图5 pH对啤酒糟水溶性蛋白含量的影响Fig.5 Effect of pH on BSG soluble protein content

pH影响酶活力的原因可能是过酸或过碱可以使酶的空间结构受到破坏，引起酶构象的改变，酶活性丧失。当pH改变不很剧烈时，酶虽未变性，但活力受到影响。其次，pH还影响底物的解离状态，或者使底物不能和酶结合，或者结合后不能生成产物;再次，pH影响酶分子活性部位上有关基团的解离，从而影响与底物的结合或者催化，使酶活性降低;最后，pH影响维持酶分子空间结构的有关基团解离，从而影响了酶活性部位的构象，进而影响酶的活性。酶在最适pH时所处的某一种解离状态，最有利于与底物结合并发生催化作用，活力最高。故选择8.0为酶解pH值。

2.2.4 酶解时间对啤酒糟水溶性蛋白含量变化的影响

在上述酶解条件下，调整酶解时间分别为1、2、4、8、16和24 h，考察不同酶解时间对水溶性蛋白含量的影响。由图6可知，酶解时间在1～8 h，水溶性蛋白含量不断提高，在8 h时，水溶性蛋白含量达到20.45%，之后随着酶解时间的延长，水溶性蛋白含量的增加趋于平缓。造成这种现象的原因可能是酶可以接触到的底物逐渐减少，并且酶活性降低所致，故选择8 h为最佳酶解时间。

图6 酶解时间对啤酒糟水溶性蛋白含量的影响Fig.6 Effect of hydrolysis time on BSG soluble protein content

2.2.5 均匀设计优化

根据以上单因素实验结果，以水溶性蛋白含量为指标，选择加酶量、酶解温度、酶解pH和酶解时间4个因素建立均匀设计。利用Data Processing System数据处理系统设计实验方案并对方案进行优化［13］，表1为均匀设计方案表。

表1 DPS实验方案设计表Table 1 DPS experimental design table

表1中的方案CD=0.185 6，较大。为了建立更全面的回归模型，表中的实验量要增加1倍，得到CD=0.101 4，表 2 显示的为实验结果［13］。

表2 DPS混合设计表Table 2 DPS mixed design table

利用DPS7.05软件，以水溶性蛋白含量为考察对象，对表2的结果进行回归拟合分析。

考察对象为水溶性蛋白含量，得到回归方程:

Y=16.37+0.88X1+2.42X2+0.93X3－0.63X4－0.42X2X2－0.22X3X3－0.08X1X3+0.26X3X4

对模型进行显著性分析，结果见表3。

方程相关系数R=0.999 2，显著水平P=0.009 4，方程显著。由DPS软件分析可知，水溶性蛋白含量最高时各因素的组合:加酶量2 400 U/g，酶解温度45℃，酶解pH 8.0，酶解时间8 h，水溶性蛋白含量的预测值为21.34%。

表3 对水溶性蛋白含量模型的显著性分析Table 3 Analysis of significance model of soluble protein content

2.2.6 验证实验

控制酶解条件为加酶量2 400 U/g，酶解温度45℃，酶解pH 8.0，酶解时间8 h，实验重复3次取平均值。水溶性蛋白含量为21.31%，提取率为54.9%，与预测值接近，优化结果有效。

2.3 饲用蛋白肽品质分析

采用上述最优条件对啤酒糟进行液态酶解，对酶解液进行真空冷冻干燥，获得饲用蛋白肽，其粗蛋白含量为78.8%。酶解液中的水溶性蛋白经过干燥后都以固态的形式保留在饲用蛋白肽中，其中氨基酸含量达到74.6%。氨基酸组成含量如表4所示。

饲用蛋白肽中的必需氨基酸含量达到了28.18%，可以有效降低饲养成本，提高动物的生长效率，赖氨酸和蛋氨酸是猪饲料中的第一限制性氨基酸，对猪的生长和料肉比有显著影响［14］。饲用蛋白肽中赖氨酸和蛋氨酸含量分别达到了2.55%和1.12%，基本上能够满足动物的生长需要。

饲用蛋白肽中多肽含量达到了60.8%，多肽可以增加蛋白质溶解性，提高消化率，作为蛋白质的降解产物更加利于牲畜的消化吸收，刺激动物的食欲，促进牲畜的生长、调节免疫，从而提高饲料转化率和肉质等［15］。

表4 饲用蛋白肽与啤酒糟中氨基酸组成对比Table 4 Comparison of amino acid composition between feed protein peptides and BSG

3 结论

啤酒糟经过机械预处理后，筛下物球磨啤酒糟粗蛋白含量提高到38.8%，比原样提高了36.1%，水溶性蛋白含量提高到2.53%，比原样提高了3.1倍。对筛下物球磨啤酒糟进行中性蛋白酶液态酶解，水溶性蛋白含量达到12.85%，说明机械预处理对酶解效率有显著的提高。在单因素实验的基础上，选取加酶量、酶解温度、酶解pH和酶解时间4个因素进行混合水平均匀设计实验，确定最优酶解条件:加酶量2 400 U/g，酶解温度45℃，酶解pH 8.0，酶解时间8 h，此时水溶性蛋白含量达到21.31%。对酶解液进行真空冷冻干燥，制备饲用蛋白肽，其中粗蛋白含量为78.8%，氨基酸含量达到74.6%，必需氨基酸含量达到28.18%，多肽含量达到60.8%。

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