侯 嘉 马伟荣 刘 洁 段 喻 郑西卫
(宁夏医科大学总医院呼吸内科,宁夏 银川 750004)
慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种气道慢性炎症性疾病,其发病同多种炎性细胞浸润及相关因子作用密切相关,早期研究集中于白细胞介素(IL)-4、IL-6、干扰素(IFN)-γ等因子,最新报道证实高迁移率族蛋白1(HMGB1)可促进多种晚期炎症因子释放,在炎症反应中扮演着重要作用〔1〕。本研究通过检测COPD患者肺组织及血清中的HMGB1及肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-1β的表达,分析前者同后两者的相关性,探讨其在COPD炎性反应过程中的作用。
1.1一般资料 选择我院2012年4月至2013年4月收治的COPD伴肺癌患者24例作为观察组,其中男14例,女10例,平均年龄(64.3±6.7)岁;选择同期住院的无COPD的肺癌患者24例作为对照组,其中男13例,女11例,平均年龄(62.1±6.4)岁。COPD诊断标准、严重程度分级、稳定期和急性加重期的定义均参考慢性阻塞性肺疾病诊疗规范(2011年版)。两组患者性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。其次,选择我科收治的诊断为COPD急性加重期患者156例,其中男114例,女42例,平均年龄(65.3±9)岁,包括轻中度84例,重度72例;呼吸衰竭80例,无呼吸衰竭76例;行胸部CT诊断有多发肺大泡58例,无肺大泡98例。稳定期COPD患者80例,其中男74例,女6例,平均年龄(57.4±10)岁。选择同期体检证实无肺功能异常的健康人80例为正常组,其中男62例,女18 例,平均年龄(58.2±9)岁。
1.2试剂及仪器 使用兔抗人HMGB1单克隆抗体,二抗即用型免疫组化Elivison plus光谱试剂盒,RNA纯化试剂盒,高容量逆转录酶试剂盒,酶联免疫吸附测定试剂盒,试剂盒均由由Mabtech公司提供。
1.3实验方法 规定实验选用的肺组织距离肺癌病灶>5 cm,均分为两份,一份立即液氮速冻-70℃冰箱保存,一份常规固定后,行石蜡包埋切片予免疫组化染色。
1.3.1HMGB1表达的检测 采用Elivison二步法检测,以已知阳性非小细胞肺癌(NSCLC)组织为阳性对照,以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗为阴性对照,分析表达强度时,于每个切片内收集5个高倍视野HMGB1阳性染色的平均积分光密度值,分析及记录过程用美国Media Cybernetics Incl公司的Image-Pro Plus图像分析系统操作。
1.3.2基因表达的检测 将50~150 mg的肺组织于1 ml Trizol中匀浆,根据试剂盒要求对总RNA提取并纯化。采用TU-1810紫外可见分光光度计检测纯化后的RNA浓度及纯度,之后用高容量逆转录酶试剂盒对其进行逆转录,并采用实时荧光定量PCR扩增引物,反应条件根据试剂盒说明进行,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)对各基因表达进行归一化处理。
1.3.3血清HMGB1、TNF-α、IL-1β 测定 空腹抽静脉血5 ml,在4℃下离心15 min后,将血清分离并置-70℃保存,每次检测前应复苏至室温。按照ELISA法说明书要求对HMGB1、TNF-α、IL-1β测定,试剂盒均由由Mabtech公司提供。
1.4统计学方法 采用SPSS13.0软件进行分析,计量资料采用s表示,计量资料采用t检验,计数资料采用χ2检验,多组间比较采用方差分析,相关性分析采用直线回归方程。
2.1肺组织中HMGB1蛋白及其mRNA表达 观察组24例标本中22例阳性,阳性率87.5%,对照组24例标本中10例染色阳性,阳性率41.6%(χ2=11.02,P<0.01)。对照组 HMGB1 蛋白的平均光密度值为 21.9±9.7,显著低于观察组的 46.2±11.5(t=7.91,P<0.05)。对照组 HMGB1 的 mRNA 转录水平为205±58,显著低于观察组的 205±58,611±88(t=14.68,P<0.01)。
2.2血清HMGB1、TNF-α、IL-1β水平比较 COPD急性加重期和COPD稳定期患者血清HMGB1、TNF-α、IL-1β水平相比对照组明显较高,且COPD急性加重期患者相比稳定期患者明显较高。重度COPD、肺部多发肺大泡患者血清HMGB1、TNF-α、IL-1β水平相比轻中度、肺部无肺大泡患者明显较高。无呼吸衰竭患者的HMGB1明显低于有呼吸衰竭患者,差异显著(t=2.122,P<0.05),而呼吸是否衰竭在 TNF-α、IL-1β 水平上无差异。见表1。
2.3相关性分析 对COPD急性加重期患者血清HMGB1与TNF-α、IL-1β水平进行相关性分析表明,两者存在显著相关(r=0.602、0.738,均 P<0.01)。
表1 血清HMGB1、TNF-α、IL-1β水平比较(s)
表1 血清HMGB1、TNF-α、IL-1β水平比较(s)
组别 n HMGB1(μg/L)TNF-α(ng/L)IL-1β(ng/L)80 1.9±1.0 39.2±15.7 14.2±10.6 COPD 稳定期 80 3.1±2.4 72.5±35.9 24.7±15.6 COPD 急性加重期 80 4.8±2.8 101.4±47.8 23.7±18.4 F/P 值 11.842/<0.05 20.461/<0.01 6.364/<0.05轻中度 84 3.6±2.1 89.2±40.5 27.2±16.9重度 72 5.8±3.4 115.6±52.1 39.5±17.1 t/P 值 4.934/0.000 3.557/0.000 4.507/0.000无肺大泡 98 3.8±2.2 92.1±45.9 30.1±17.7多发肺大泡 58 6.8±3.1 123.6±48.8 43.9±18.1 t/P 值 7.045/0.000 4.046/0.000 4.667/0.000无呼吸衰竭 76 4.2±1.9 92.6±46.5 28.5±12.9有呼吸衰竭 80 5.1±3.2 105.3±45.3 31.9±17.2 t/P值正常组2.122/0.035 0.253/0.800 1.391/0.166
HMGB1是具有多种核外生物学功能的非组蛋白,其可高水平表达于急性肺损伤、过敏性肺炎等肺部疾病中,有研究认为该物质具有广泛促炎性细胞因子样作用,通过介导炎症反应,参与了肺部疾病的病理过程。如有研究通过对COPD患者支气管上皮细胞与肺泡灌洗液进行检测后发现,HMGB1表达明显高于无COPD患者及正常对照〔2~4〕。动物实验研究亦证实HMGB1可高表达于COPD组大鼠支气管上皮,且其同气道、肺血管结构的病理变化相一致〔5~8〕。
本研究结果提示HMGB1或许参与到了COPD的气道炎性反应过程中。进一步研究发现,COPD急性加重期患者血清中的HMGB1水平相比COPD稳定期患者较高,重度COPD与肺部多发肺大泡患者相比轻中度与无肺大泡患者较高,无呼吸衰竭患者的HMGB1明显低于有呼吸衰竭患者,可推断血清HMGB1水平或许可反映COPD炎性反应与病理改变的严重程度,同既往研究结果类似〔9〕。本研究结果表明HMGB1与血清TNF-α、IL-1β水平在炎性反应中存在相互关联。有研究发现HMGB1或许可通过IL-1β及晚期糖基化终末产物受体参与到了COPD气道炎症反应及与组织重构中〔10〕。HMGB1同其受体结合后,通过活化核转录因子(NF-κB),将包括 IL-1β、TNF-α在内的炎性因子大量释放,促进炎性反应,并通过正反馈进一步增加 HMGB1 的分泌,扩大炎性反应范围〔11,12〕。
综上所述,通过研究可以认为,在COPD病程中,HMGB1于肺组织和血清中高度表达,并同TNF-α和IL-1β等多种炎性介质相互作用,扩大炎症反应,促进疾病进展。今后在临床诊疗中,可考虑将HMGB1作为治疗靶点,或许可在控制疾病急性及慢性进展中起到有利作用。
1 罗红艳,兰小梅,曹 丽,等.慢性阻塞性肺疾病患者早期肾损害的生物标志物评价〔J〕.宁夏医科大学学报,2013;35(6):626-30.
2 程 哲,康 燕,吴秋歌,等.HMGB1在支气管哮喘和慢性阻塞性肺疾病患者中的表达及其意义〔J〕.中华医学杂志,2011;91(42):2981-4.
3 贺小燕,王海琳,陈晓红,等.HMGB1在卵巢癌中的表达及临床意义〔J〕.现代生物医学进展,2011;11(4):695-7.
4 Wang CM,Jiang M,Wang HJ.Effect of NF-κB inhibitor on high-mobility group protein B1 expression in a COPD rat model〔J〕.Mol Med Rep,2013;7(2):499-502.
5 王昌明,蒋 明,王会娟,等.HMGB1表达水平与慢性阻塞性肺病大鼠模型气道,肺血管重构的关系及其临床意义〔J〕.重庆医科大学学报,2012;37(2):114-7.
6 乔云兰,梅晓冬.高迁移率族蛋白B1在香烟诱导的慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺部的表达〔J〕.安徽医科大学学报,2012;47(1):9-12.
7 王 震,梅晓冬,蒋旭琴,等.高迁移率族蛋白 B1在香烟暴露大鼠模型中的表达〔J〕.中国老年学杂志,2011;31(14):2681-3.
8 Hou C,Zhao H,Liu L,et al.High mobility group protein B1(HMGB1)in asthma:comparison of patients with chronic obstructive pulmonary disease and healthy controls〔J〕.Mol Med,2011;17(7-8):807-15.
9 杨晓敏,杨 华.慢性阻塞性肺疾病患者肺组织和血清高迁移率族蛋白B1的表达〔J〕.实用医学杂志,2013;29(18):3009-11.
10 杨晓敏,杨 华.高迁移率族蛋白B1在肺结核患者肺组织和血清中的表达〔J〕.中华结核和呼吸杂志,2013;36(7):497-500.
11 张固琴,杨 炯,李 平,等.血清HMGB1水平评价哮喘严重程度和控制水平的价值〔J〕.临床肺科杂志,2013;18(5):890-2.
12 王桂良,文剑波,文 萍,等.丙酮酸乙酯对重症急性胰腺炎大鼠TNF-α HMGB1及 IL-10表达的影响〔J〕.中国急救医学,2012;32(9):818-22.