体外培养的视网膜Müller细胞的形态学特性及细胞内信号传导通路

孙雅彬 王大广 宋 鄂 叶 飞 张 泳 孙雅敏 徐越超

(吉林大学第一医院眼科，吉林 长春 130021)

Müller细胞是视网膜主要的神经胶质细胞，在生理和病理情况下均起到重要的作用。解剖发现，Müller细胞、神经元以及血管之间存在一种特殊的密切的生理关系，通过Müller细胞可以快速检测视网膜的自我平衡并做出回应〔1，2〕。视网膜是体内耗能最高的组织，Müller细胞通过新陈代谢为视网膜为提供代谢能量〔3〕。Müller细胞直接向高耗能的光感受器〔4〕运送营养，包括葡萄糖、乳酸盐、丙酮酸以及氨基酸〔5,6〕。与光感受器完全相反，Müller细胞对低氧、缺氧症以及低血糖症具有很强的耐受能力〔7〕。 Müller细胞通过糖原沉积，延长了其在有害环境下的生存期〔8〕。基于Müller细胞在视网膜中的重要作用，本研究通过体外培养的大鼠视网膜Müller细胞内信号传统通路的研究，为各种视网膜疾病的机制研究提供新的依据。

1 材料与方法

1.1Müller 细胞的形态学观察 根据我们的既往研究体外培养及鉴定大鼠视网膜Müller细胞〔9〕。于倒置相差显微镜下观察培养液有无污染，观察从大鼠视网膜分离出的Müller细胞贴壁情况，以及细胞在体外培养过程中的形态变化、生长特性等。

1.2蛋白通路分析 Müller 细胞(1×106) 于10 cm培养皿内无血清DMEM培养24 h。用1倍细胞裂解液(Cell Signaling Technology公司，美国Danvers)包含20 mmol/L Tris-HCl (pH7.5)，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L Na2EDTA，1 mmol/L EGTA，1% Triton，2.5 mmol/L焦磷酸钠，1 mmol/L β-甘油磷酸钠，1 mmol/L Na3VO4，1 μg/ml亮抑蛋白酶肽，提取细胞总蛋白。 每个培养皿中加入300 μL裂解液，用细胞刮板刮除培养皿表面的单层细胞。细胞裂解产物超声裂解15 s，2次，14 000 r/min，4℃，离心30 min。BCA蛋白质分析试剂盒(Pierce公司，美国Rockford)检测蛋白质浓度。每孔加入300 μg蛋白质，10%聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，转至尼龙膜上。将尼龙膜以5%的牛奶或3%牛血清蛋白在室温下封闭1 h。将尼龙膜固定在免疫印迹杂交盒内，杂交盒有20条杂交道，每条杂交道可加2～3种一抗，抗体结合到蛋白质上，4°C孵育过夜。 清晰印记后，与二抗在室温下杂交1 h。清洗尼龙膜后加入化学发光液。用凝胶成像系统拍摄化学发光信号。用光密度扫描系统测定蛋白质含量，并且使用内参制定测定标准。

1.3信号传导网络分析 应用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)，进行蛋白质之间生物功能的关联性分析。 将PPA中检测到的表达的蛋白质输入IPA软件，进行经典信号传导通路的功能性分析〔10〕。以IPA软件内已知文献中各基因或蛋白质的相互作用为基础，将输入蛋白质之间的直接或间接的作用进行分析，并最终构建出新的信号通路。

1.4统计分析 所有的细胞培养实验均在不同时间重复3次。PPA重复2次。应用IPA软件进行信号通路分析。

2 结 果

2.1体外培养的大鼠视网膜Müller 细胞的形态 自大鼠视网膜分离出的原代组织块为无色半透明，Müller细胞呈无色透明小圆点状，漂浮于培养液中(图1A)；约24～48 h大部分细胞贴壁生长，呈短梭形，无色透明，组织块周围可见短梭形细胞伸出(图1B)；3～5 d，细胞体态逐渐变长，两端出现分支，无色透明(图1C)，7～10 d，细胞密集生长呈长梭形，平行有序排列，无色透明(图1D)，可以传代供实验使用。

A：原代培养；B：24～48 h；C：3～5 d；D：7～10 d

2.2视网膜Müller细胞中的信号传统网络 应用146种磷酸化及磷酸化蛋白质的抗体进行检测，发现有108种磷酸化和非磷酸化蛋白质在体外培养的视网膜Müller中表达：磷酸化蛋白：p-PKCα, p-PDK1, p-PKC α/βII, p-p53, p-Akt, p-PTEN, p-RB, p-β-catenin, p-c-Jun, p-Stat3, p-ERK, p-GSK-3α/β, p-p70 S6 kinase, p-eIF4B, p-HGFR, p-Smad, p-ERK5 , p-p90RSK, p-CREB, p-PKCδ, p-FAK, p-cdc2, p-Stat5, p-p38；非磷酸化蛋白：FAS, FOXM1, Syk, MetRS, Twist, Lyn, KLF6, CaMKKα, SK3, Stat1, cyclin B1, cyclin D1, Cdk6, Cdc25B, cyclin E, Cdk2, p27, TDP1, Cdk4, HER2, 14-3-3β, cPKCα, ERK, EGFR, SLUG, Cdc25C, Hsp90, CHK1, MDM2, Cdc2 p34, E2F-1, PCNA, p63, p38, Rap 1, β-catenin, Akt, HCAM, XIAP, Bcl-2, patched, HIF-1α, HIF-2α, TTF-1, p53, Notch4, PTEN, SRC-1, Eg5, HIF-3α, Bax, N-cadherin, TNF-α, Cdc42, eIF4B, vimentin, OPN, survivin, E-cadherin, TGF-β, ERβ, WT1, mesothelin, VEGF, ATF-1, Ep-CAM, Bad, NFκB52, NFκB p50, calretinin, IL-1β, H-Ras, Bcl-6, K-Ras, α-tubulin, NFκB p65, CREB, BID, maspin, DRG1, factor XIII B, IGFBP5, HCAM, ICAM-1, ERα, c-Flip, PSM, Rab 7, VCAM-1, FGF-8, NEP, Bcl-xL, endoglin, Bak, TFIIH p89, Nkx-3.1, RIP, NM23, c-IAP2, Epo, uPA, PDEF, Stat 3, ERCC1, uPAR, KAI1, L-selectin, PSCA, E-selectin。

基于IPA结果，这些蛋白质参与了几条重要的信号传导通路，包括XIAP/Apoptosis信号通路(p-p53, NFκB p65, p38, Bax, NFκB p50, c-IAP2, TNF-α, Bak, XIAP)，PI3K/AKT 信号通路(p-p53, NFκB p65, p-Akt, p38, 14-3-3 β, Hsp90, p-GSK-3α/β, NFκB p50, Cyclin D1, PTEN)，ILK信号通路(VEGF, NFκB p65, p-Akt, p38, p-GSK-3α/β, HIF-1α, NFκB p50, Cyclin D1, TNF-α, PTEN)，PTEN信号通路(NFκB p65, p-Akt, p-p38, p-GSK-3α/β, NFκB p50, Cyclin D1, Bcl-xL, PTEN)，细胞周期：G1/S 节点调控信号通路(p-p53, p-RB, Cyclin E, Cdk4, Cdk6, Cyclin D1, Cdc2 p34)，HIF-1α信号通路(VEGF, Epo, p-p53, p-Akt, p38, Hsp90, HIF-1α)，细胞周期：G2/M 节点调控信号通路(Cdc25B, p-p53, Cdc25C and Cyclin B1, 14-3-3 β)，HGF信号通路(p-Akt, p-p38, p-Stat3, Cyclin D1, Cdc2 p34)，糖尿病信号通路(NFκB p65, p-Akt, p38, NFκB p50, TNF-α)，NFκB 信号通路(NFκB p65, p-Akt, RIP, IL-1β, NFκB p50, TNF-α)，VEGF 信号通路(VEGF, p-Akt, p38, HIF-1α)，ERK/MAPK信号通路(p38, p-GSK-3α/β, p-Stat3)和胰岛素受体信号通路(p-Akt, p38, p-GSK-3α/β, PTEN)。提示Müller 细胞中信号传导通路共同决定Müller细胞的生物学特性。

3 讨 论

Müller细胞通过上调营养因子以及抗氧化物为视网膜提供直接和间接营养支持。主要的细胞因子和生长因子包括脑衍生神经营养因子、碱性纤维母细胞生长因子、睫状神经营养因子、胰岛素生长因子1、神经胶质源性神经营养因子、白血病抑制因子、神经营养因子-3以及色素上皮衍生因子〔11～14〕。这些因子可能单独或共同起作用并通过直接或间接机制保护应激的神经元。例如，Müller细胞可能会直接释放碱性纤维母细胞生长因子以支持应激的神经元〔15〕，或者Müller细胞可能会通过激活应激诱发白血病抑制因子或通过注射α2肾上腺素能激动剂上调碱性纤维母细胞生长因子〔13,16〕。Müller细胞也会通过上调抗氧化物保护光感受器免受氧化损伤，如谷胱甘肽、铁氧化酶、血浆铜蓝蛋白以及血红素氧化酶〔14〕。

Müller细胞会传递能够吸收和循环神经传导物质的转运体和酶。谷氨酸是一种基本的视网膜神经传导物质，而且必须对它进行严格的监管以保护视网膜免受兴奋性损伤或者是为高分辨率(高的信噪比)视觉信号而对其进行监管〔17,18〕。

通过Müller细胞传递的兴奋性氨基酸转运体 (EAAT)1～5，尤其是EAAT 1/天冬氨酸转运体，迅速地将过量的谷氨酸移出细胞外隙〔2,19〕。然后，通过谷胺酰胺合成酶将谷氨酸转化成谷氨酰胺，谷胺酰胺合成酶是一种位于Müller细胞中的酶〔20〕，由于这个过程是非常有效率的，所以Müller细胞对健康视网膜中的谷氨酸是免疫的〔21〕。严格地说，药理的谷胺酰胺合成酶的抑制作用会导致动物在2 min内失明〔21〕。然后，将谷氨酰胺运回至光感受器内，至此，整个循环过程结束〔22〕。Müller细胞也会为其他的神经传导物质传递转运体以及再循环系统，包括γ氨基丁酸和氨基乙酸〔2〕。

本研究的结果提示Müller细胞内存在多个不同的信号传导通路，这些信号通路间有交叉与关联，它们共同决定着Müller细胞的生物学特性。

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