人感染H6N1禽流感病毒HA基因的分子特征及进化分析

杨建课，宫 磊，高继光，林爱琴，徐思斌

2.皖南医学院医学遗传学研究室；

Email：ajiankebc＠126.com

A型禽流感病毒属于正粘病毒科流感病毒属，在全世界范围内的家禽、野鸟、哺乳动物及人类中广泛传播[1]。该病毒基因组拥有8条负RNA链，至少编码11种不同功能的蛋白质。依据其表面血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）的抗原性，将其分成16个HA亚型和9个NA亚型，最近又在一些蝙蝠体内分离并鉴定出了新的H17N10亚型[2]。这些病毒对人类的生活和健康都构成了极大的威胁。

虽然人们早已分离出低致病性禽流感病毒（LPAI）H6N1，且研究表明其在一定条件下具有在人和哺乳动物间交叉感染的能力[3－4]，但很少见到人感染的病例。2013年6月，台湾发现了首例人感染H6N1禽流感病例[5－7]，引人关注。特拟对人感染H6N1禽流感病毒的HA基因及其近缘序列的分子特征及进化分析，以探求其变异规律、致病机制、来源及进化情况，为禽流感病毒的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 数据来源 通过Blast方法从美国国立生物技术信息中心（NCBI）流感病毒资源库（Flu）和全球禽流感基因共享数据库（GISAID）中获得人感染H6N1禽流感病毒HA基因及近缘序列共47条，其中42条来自台湾（如表1）。经 MAFFT version 7.110比对和BioEdit version 7.2.1人工校正后作为分析数据集。

1.2 系统发育树重建 分别采用最大似然法（ML）、最大简约法（MP）、贝叶斯推理法（BI），以A／CK／TW／G23／87（DQ376692）为外类群，jModelTest version 2.1.4的AIC标准计算的GTR＋G为最适模型，重建其系统发育树。其中ML、MP树分别在软件 PhyML3.0、PAUP version 4.0b10中运算执行，自举检验值（Bootstrap）1 000次重复检验；BI树由MrBayes 3.2运算获得，4个独立的马可夫链－蒙特卡罗（MCMC）数据模拟技术运算1百万代，每100代取样一次，舍弃前2 500个老化样本（burnin）后，其余样本用来推测后验概率。

1.3 分子特征分析 分别通过NetNGlyc 1.0、NetOglyc 4.0预测氨基酸序列的N－糖基化位点和O－糖基化位点。以人感染H6N1禽流感病毒的HA蛋白序列为参考，分析其变异位点和裂解位点的特征，并通过 ProtParam、DiANNA 1.1、SignalP 4.1分别预测其理化性质、二硫键和信号肽的位置。

1.4 进化速率和分歧时间推断 采用GTR＋G模型、贝叶斯轮廓式（Bayesian Skyline）种群增长模式和对数正态分布松弛分子钟模型（CoV＞0），通过BEAST v1.7.5推测42条台湾数据的进化速率（位点／年）和最近共同祖先（TMRCA）时间。2个独立的MCMC数据模拟技术运算5千万代。FigTree v1.4.0显示树的拓扑结构和相关信息。

2 结 果

2.1 系统发育分析 为更准确分析人感染H6N1禽流感病毒HA基因的来源和进化历程，我们分别构建了ML、MP和BI树，三种树的拓扑结构基本一致，仅支持率略有不同（如图1）。根据树的拓扑结构、支持率、病毒出现的时间、地点和序列特征等分析，由A／CK／TW／G23／87进化而来的46株病毒聚为两支。支1所含毒株均来自台湾，支持率 ML／MP／BI分别为99／99／1，其内部进一步聚成三个亚支，其中支1.3支持率为99／99／1，包括 A／CK／TW／PF3／02及1999至2004年间分离的11株病毒；支1.2支持率为100／100／1，共4株病毒，其中人感染 H6N1禽流感病毒（A／TW／2／13）与A／CK／TW／A2837／13亲缘关系最近，互为姐妹支，再与2004和2005年的两株禽感染病毒聚在一起；支1.1的支持率为85／86／0.96，含有2001至2010年间分离的20株病毒，毒株数最多。支1.1和1.2互为姐妹 支，再 与 A／CK／TW／1205／01 和 A／CK／TW／0329／01聚在一起，支持率分别为88／86／0.88和100／100／1。支2支持率为81／76／1，含5株来自广西和荷兰的禽流感病毒，寄主全为水禽，距根部最近。

2.2 HA蛋白的分子特征 人感染H6N1病毒的HA蛋白的分子量约为63.6KDa，等电点为6.07，由567个氨基酸残基组成，其中亮氨酸（L）含量最高（8.3%），组氨酸（H）最少（1.6%）。1至16位为信号肽序列，引导新合成的HA蛋白进入内质网。序列共有15个半胱氨酸（C），可形成7个二硫键（6与92、44与479、57与137、279与552、283与468、307与475、542与549）；含有5个 N－糖基化位点（第13、25、169、293、544位）和2个 O－糖基化位点（第130、134位）（如表1），其中N－糖基化位点在不同支系间较为保守，O－糖基化位点变异较大（支2多为一个、支1.3多为三个，支1.1和1.2多为两个）。HA1和HA2的裂解位点位于第331和332位间，其上游序列PQIATR，较为保守，仅含有一个碱性氨基酸，其中裂解位点上游第三位氨基酸（即329位）变异较大，较早分离的几株病毒为赖氨酸（K），而支1.2的4株病毒为特有的丙氨酸（A），其余毒株为谷氨酸（E）。虽然人感染H6N1禽流感病毒的HA蛋白序列第193N、226Q、228S与其它禽感染病毒一致，但P186L、A287T为其所特有。此外，55K、100L、157D、160T、200K、238R、480M、495K为毒株 A／TW／2／13和 A／CK／TW／A2837／13特有，86N、273D、329A为支1.2所特有。

2.3 进化速率和TMRCA时间推测对来自台湾的42条HA基因进行了进化速率（位点／年）和TMRCA推测，结果如表2。节点C进化速率最大，为5.99×10－3位点／年，说明支1.2的进化速速最快；节点F次之，为5.90×10－3位点／年；而节点B进化速率最小，为4.40×10－3位点／年，说明支1.3进化的最慢。节点D所代表的最近共同祖先时间为2012年，故推测人感染H6N1禽流感病毒的HA基因于2012年早期由家禽的序列进化而来。此外，C、D节点间枝长较长，TMRCA相差10年之久。

表1 人感染H6N1及近缘禽流感病毒HA基因的登录号及糖基化位点（参考H3序列位置）Tab.1 Accession numbers and glycosylation sites of the HA gene from human－infecting H6N1and allied avian influenza virus（H3 numbering）

表2 不同节点的进化速率（位点／年）和最近共同祖先（TMRCA）时间Tab.2 Substitution rates（sites／year）and the most recent common ancestor（TMRCA）of some significant nodes

图1 人感染H6N1及近缘禽流感病毒HA基因的系统发育树图。支上数字分别表示 ML、MP、BI树的支持率，大写的英文字母代表一些重要的节点，加粗数字表示不同的支。Fig.1 Phylogenetic trees of the HA genes from human－infecting H6N1and allied avian influenza virus by maximum likelihood（ML），maximum parsimony（MP）and Bayesian inference（BI）

3 讨 论

虽然相对于高致病性的H7N9[8]，低致病性的H6N1对人的危害性较小，但其对家禽的孵化率、死亡率及产蛋量等影响很大[4]，且可能与其它禽流感病毒重配产生新型高致病性流感病毒，如A／Hong Kong／156／97（H5N1）的产生[9]，应高度关注。截止目前，由 A／CK／TW／G23／87进化而来的 H6亚型至少有2种类型——支1和2，支2病毒主要出现在欧洲和中国的南部，支1病毒全分布在台湾。其中亚支1.3所含病毒出现时间相对较早，进化速率小，可能已不是优势种群，甚至已完全消失。而亚支1.1、1.2病毒可能为当地优势种群，正在流行且进化速度快，说明其还在不断的进化和适应环境。人感染H6N1禽流感病毒HA基因属于亚支1.2，高的支持率和一些特有的氨基酸位点，都表明这是早在2002年就进化出的新类型，并已适应外部环境。然而目前分离的毒株并不多，可能因为其低致病性，很多毒株未被发现，节点C、D间的长枝也说明如此[7]。Wei等[6]研究认为，人感染H6N1禽流感病毒HA基因可能由A／CK／TW／PF3／02，经A／CK／TW／0204／05进化而来，而我们的结果不完全支持此观点。支1.1和1.2先与A／CK／TW／1205／01、A／CK／TW／0329／01聚在一起后再与A／CK／TW／PF3／02所在的支1.3互为姐妹支，结合有关数据[5，7，10]可见：人感染H6N1禽流感病毒HA基因最早由A／CK／TW／G23／87，经A／CK／TW／0824／97、A／CK／TW／1205／01、A／CK／TW／0204／05，直到2012年由家禽的序列进化而产生，与A／CK／TW／PF3／02（H6N1）病毒为共进化关系。

HA蛋白以同源三聚体的形式镶嵌在病毒表面，作为主要的表面抗原，与病毒复制、毒力及宿主特异性等密切相关。研究表明，裂解位点上游碱性氨基酸的数目决定着HA蛋白能否被裂解成HA1和HA2，进而影响病毒的复制和毒力[11－12]。人感染H6N1禽流感病毒HA蛋白的裂解位点上游6个氨基酸里仅有1个碱性氨基酸，表明其仍是低致病性的[6－7]，但位点328、329（裂解位点上游第4、第3位）具有很大的变异性，可见其受到很大的选择压力，将来有可能进化产生高致病性的人感染H6亚型流感病毒。前人研究还表明HA蛋白的第226位（参照H3序列）如为Q，则特异性地与禽类含唾液酸α－2，3半乳糖的糖蛋白受体结合；如为L，则特异性地与人类含唾液酸α－2，6半乳糖的糖蛋白受体结合；此外，193R、228G、糖基化位点等也与宿主的特异性有关[11，13－14]。人感染H6N1禽流感病毒H蛋白193N、226Q、228S未表现出人感染型的特性，可能尚未来得及进化，但特有的P186L也许是其感染人的原因[7，13]。同时，特有的A287T在病毒宿主的选择上是否具有一定作用，目前还不清楚。该蛋白拥有5个N－糖基化位点，其中4个位于HA1区，1个位于HA2区，5个位点都比较保守，表明其具有重要的生物学功能[15]。同时拥有2个O－糖基化位点，具体功能未知，但在不同类群间有所变异，这可能是适应性进化的结果。

综上，人感染H6N1禽流感病毒的HA基因由家禽的进化而来，并具备了感染人的能力，由于其高的进化速率和病毒重配的可能性，加以时日有可能进化出新型高致病性的H6亚型，人们应高度重视，并能及时的给与监测和防治。

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