猪支原体肺炎常用实验室诊断方法概述

于新友，李天芝，王金良，李书光，苗立中，沈志强,

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600）

本文对猪支原体肺炎的临床症状、病理学变化、酶联免疫吸附试验及PCR诊断方法的最新研究进展及各种诊断方法的优缺点进行全面概述，以期为实验室尤其是基层兽医工作者对猪支原体肺炎的早期诊断和及时防治提供一定的指导，为预防和控制猪支原体肺炎奠定基础。

猪支原体肺炎又称猪喘气病，是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）引起的一种慢性呼吸道传染病，临床上以咳嗽、气喘和肺部典型的“虾肉”样变为特征，具有接触传染性高、死亡率低和诱发性强的特点。Mhp是重要的猪支原体病原之一，可导致猪地方性肺炎。不同年龄、性别、品种的猪群均可感染，以咳嗽和气喘为主要症状。虽然本病死亡率不高，但严重影响猪群的生长，导致料肉比增大、饲料报酬率降低。据不同国家的屠宰检验统计表明，猪支原体肺炎的典型病变率达30%～80%。因此，对猪支原体肺炎正确诊断非常重要。

1 临床症状

猪支原体肺炎有明显的喘气症状，咳嗽，腹式呼吸，体温及食欲变化不大而生长发育迟缓，多在天气变化、饲养管理方式改变等应激因素的作用下诱发本病。根据病的经过，大致可分为急性、慢性和隐性三种类型，而以慢性和隐性最多，但所有这些类型可随条件的变动而互相转变，不能截然区分。急性型：常见于新发本病的猪群，尤以怀孕母猪、仔猪多见。病猪体温正常（伴有继发感染时可升至40℃以上），精神不振，呈腹式呼吸。慢性型：常见于老疫区的架子猪、育肥猪和后备母猪。早、晚吃食后或运动时发生咳嗽，咳嗽时，站立不动，背拱起，颈伸直，头下垂，直至咳出分泌物为止。随着病程的发展，常出现不同程度的呼吸困难。体温一般正常，发育迟缓。隐性型：偶见咳嗽和气喘，生长发育几乎正常。一般情况下死亡率不高，但继发性感染也造成严重死亡。诊断本病应以一个猪场整个猪群为单位，当猪群中发现一头病猪，就可以认为是病猪群。

2 病理变化

剖检发病严重及病死猪可见病变主要在肺脏、肺门淋巴结和纵隔淋巴结。当病处在炎症发展期，肺脏膨大，有不同程度的气肿和水肿。双肺的心叶、尖叶、中间叶和部分病例的膈叶前下缘出现对称性、融合性支气管肺炎病变，其中以心叶最明显，尖叶和中间叶次之。病变部位呈淡灰红色或灰红色、半透明状、界限明显、指压无弹性、似鲜嫩的肌肉状，俗称“肉变”。随着病程的延长和病情的加重，病变部位的颜色也逐渐加深，呈淡紫色、深紫色或灰白色、灰黄色，坚韧度增加，外观像胰脏样，俗称“胰变”或“虾肉样变”。切面湿润致密，支气管流出浑浊、灰白色带泡沫的浆液性或黏液性液体。肺小叶间结缔组织增生、硬化。肺门淋巴结和纵隔淋巴结显著肿大数十倍，呈灰白色，水肿，切面边缘外翻，有时出现轻度充血。肝脏、脾脏、肠管表面覆盖纤维素性渗出物；肝脏肿大、变硬，胆囊萎缩无胆汁；肾脏表面凹陷、有出血点；关节腔充满黄绿色纤维素性、化脓性液体；肺淋巴结和腹股沟淋巴结肿大，切面有渗出物；脑膜水肿、出血。

3 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验既可以检测抗原，也可以检测抗体，具有快速、简便、特异性强、敏感性高的优点，可用于大批量样品的检测。ELISA是目前国内外最常用于诊断Mhp的方法之一，具有能进行定量分析、敏感性高、特异性强的特点。刘茂军等选用MhpJ株培养物制备抗原，建立检测Mhp抗体的间接ELISA(酶联免疫吸附)方法。对136份样品检测结果表明，建立的Mhp间接ELISA抗体检测方法与美国IDEXX公司生产的Mhp抗体检测试剂盒检测的符合率达到83.8%，假阴性率8.8%，假阳性1.5%。逯晓敏等建立了稳定而特异的抗MhpIgA的间接ELISA检测方法。批间与批内试验结果证明该方法具有很好的稳定性。初步应用表明，该方法可用于Mhp感染或免疫状态的临床监测。祝永琴等将已构建的含有MhpP36基因的酵母表达质粒pPICZA-A-P36在酵母菌X-33里进行表达，并对表达的蛋白进行Western-blotting鉴定。建立了稳定的抗Mhp IgG的间接ELISA检测方法。应用该方法检测猪鼻支原体、猪絮状支原体、猪圆环病毒阳性血清等都是阴性，说明该方法具有良好的特异性。批内重复性试验和批间重复性试验的变异系数均小于8%，说明该方法具有良好的重复性。张长莹等以原核表达纯化的猪支原体MSG1重组蛋白为包被抗原，建立了检测猪支原体的间接ELISA诊断方法。该检测方法敏感性高、特异性强和可重复性好。该研究表明建立的间接ELISA方法为猪支原体的检测和区域流行病学调查提供了一种快速简便的血清学诊断方法。刘茂军等利用MhpNJ株的DnaK基因通过SOE-PCR扩增和突变，获得了目的片段并插入表达载体pET-28a(+)中，然后转入宿主菌BL21(DE3)。重组质粒经1毫摩尔/升IPTG在37℃温度下诱导5小时，目的蛋白可达到总蛋白的14.1%。WesternBlotting证明表达的重组蛋白具有Mhp反应原性，用该重组蛋白建立的ELISA方法可检测到Mhp抗体。

4 PCR方法

PCR技术具有灵敏、特异、快速、简便等优点，是实验室常用的分子生物学诊断技术，也是目前猪支原体肺炎准确、简单、快速诊断的主要方法。

4.1 常规PCR

利用聚合酶链反应(PCR)可以快速地对培养物、肺脏、鼻拭子、支气管洗液进行检查，取得了令人满意的结果。于敏等根据国内外发表Mhp 16srRNA基因设计了一对特异性引物，扩增出一个大小为653bp的特异性片段，敏感性试验显示这对引物能够检测到1ng的DNA，结果表明此方法特异且敏感。刘茂军等根据Mhp的P36基因序列设计一对引物，建立了Mhp特异且敏感的PCR检测方法，可区别猪鼻支原体、絮状支原体和鸡毒支原体，最低检出量为4.26ng。张红云等根据GenBank中MhpJ株P36蛋白基因的核苷酸序列设计1对引物，建立了快速检测Mhp的PCR方法。采用所建立的PCR方法对42份疑似猪支原体肺炎（MPS）病料进行临床诊断，发现有13份呈阳性（31.0%）。该PCR方法适合于MPS的临床诊断，可为其防控提供可靠依据。王贵平用PCR方法对从湖南省长沙市收集的326份病料分别进行了Mhp和猪鼻支原体检测，并对部分基因进行了序列分析。结果发现，Mhp检出率为24.4%。朱凤琼等通过设计1对针对16srRNA的引物，建立了该病原的PCR检测方法，该方法能从标准株和分离株中获得阳性扩增，但不会与其他种类支原体或者是猪呼吸道中的常见微生物发生交叉反应。为证实扩增产物的特异性，对2个PCR产物进行纯化、测序和序列分析，证实为肺炎支原体。

4.2 套式PCR

套式PCR又称巢式PCR，即在第一对引物（外套引物）的扩增区域内另行设计一对引物（内套引物），用外套的扩增产物做模板进行第二次扩增。套式PCR外套扩增增加了起始模板量，内套引物扩增将目的基因进一步倍增至可观察的量，由于采用两对不同的引物二级放大，故可提高PCR检测的灵敏度，保证产物的特异性，使灵敏度和特异性高于传统的PCR方法。逯晓敏等根据GenBank中登录的MhpP36(L-乳酸脱氢酶)全基因序列，设计合成了2对引物，建立套式PCR方法。运用该方法对Mhp不同菌株培养物进行了扩增，并对经肺内免疫猪支原体肺炎活疫苗后支气管肺泡灌洗液进行了检测。结果表明，不同菌种均能扩增出427bp的目的条带，而其他病原菌未出现特异性扩增条带。建立的套式PCR方法检测Mhp的最低检测限度为10个CCU(颜色变化单位)。吉玛等建立了检测Mhp的巢式PCR方法。结果表明，该方法对鸡毒支原体、猪鼻支原体、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪圆环病毒Ⅱ型、猪伪狂犬病毒的扩增结果均为阴性；第1次扩增的敏感性是10皮克，第2次扩增的敏感性是0.1皮克。

4.3 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR是将PCR技术和光谱技术有效结合的一种核酸定量技术，克服了普通PCR反应时间较长、扩增产物需用琼脂糖凝胶电泳检测、易出现假阳性等缺点，具有灵敏度高、特异性强、定量准确、全封闭反应等优点。宋建领等根据GenBank登录的Mhp黏附素P97基因序列，设计1对特异性引物和1条探针，优化了Mhp实时荧光定量PCR检测方法。结果显示，该方法能特异地检测Mhp，与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒、乙型脑炎病毒，猪细小病毒、猪圆环病毒等病原检测无交叉反应；针对Mhp阳性质粒标准品检测，灵敏度可以达到10拷贝；重复性检测Ct值变异系数在0.78%～1.16%之间。用建立的实时荧光定量PCR检测方法，对40份临床样品检测，结果表明肺脏拭子与肺脏悬液阳性率完全一致，而鼻腔拭子检出率较低。同戈等建立了以P110基因序列作为靶序列的MhpSYBRGreen荧光定量PCR检测方法，该方法具有良好的特异性、重复性，能够检测到10复制/微升的标准质粒，可用于Mhp培养疫苗半成品的快速定量检测。丁敏等根据Mhp保守区域P110基因序列，设计一对特异引物和TaqMan探针，同时构建了P110基因标准质粒，并对TaqMan荧光定量PCR反应条件进行了优化，建立了可以对Mhp培养物定量的荧光定量PCR检测方法。研究结果表明，该方法检测灵敏度可达13复制/微升。

5 环介导等温扩增方法

环介导等温扩增方法是日本学者Notomi等在2000年发明的一项恒温核酸扩增新技术，具有操作简便、快速、高效、敏感、特异、经济等特点，特别适合在现场和基层部门应用。郭盼盼等建立了MhpLAMP的快速检测方法，该方法以Mhp保守性基因16SrRNA为靶序列设计了6条特异引物，在63℃等温条件下，30分钟即可完成反应。结果显示，LAMP技术优于PCR技术。在敏感性试验中，LAMP方法的能检测出10个包含靶基因片段的重组质粒，敏感性高于PCR方法10倍；特异性试验中，LAMP方法和PCR方法均显示出了高度的特异性；在对127个临床鼻拭子样本的检测中，LAMP方法检测结果是所有样本都为阳性，而PCR检测出了116份阳性。证明所建立的方法，对临床样本的检测的敏感度高于常规的PCR法。李鹏等根据GenBank中登录的Mhp的核苷酸序列，设计4条特异性引物，用外引物进行PCR反应，对内外引物浓度、dNTP＋和MgSO4浓度及BstDNA聚合酶用量等进行优化，建立MhpLAMP检测方法，应用该方法检测多杀性巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、肺炎双球菌、支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌和链球菌均呈阴性；当Mhp的拷贝数高于3时，均可检测到该病原体。LAMP方法快速、灵敏、特异、无需特殊的仪器，为基层实验室Mhp的检测提供了简单快速的方法，特别适合基层实验室或养殖场在临床中应用。

6 结语

病原的快速而准确的诊断是解决当今威胁畜牧业的各类传染病的决定性因素。用于猪支原体肺炎的诊断方法很多，实时荧光定量敏感性比常规PCR和套氏PCR高，但同时对操作人员、仪器设备与试剂要求太高，一般实验室很难具备试验条件。ELISA方法具有敏感性和特异性强、操作简单、检测快速、重复性好、无辐射、准确性高的优点，适合基层进行大批量检测。LAMP特异性强、灵敏性高、成本低、不需要PCR仪，仅需要一个恒温水浴锅即可完成核酸的扩增，特别适合基层部门应用。无论哪一种方法都不能彻底解决所有的问题，可以根据试验的目的和要求，选择最适宜的检测方法或将几种检测方法组合起来应用，做到早发现、早治疗、力争从根本上解决该病的防控问题。随着分子生物学进一步发展，相信一些特异性强、灵敏性高、简便易行的新型诊断方法终将问世并得以推广应用。