煤工尘肺患者血清中颗粒酶B抗体的表达及其意义

裴阳晴，刘素娜，暴 磊，张红义，侯建永，郝长付，姚 武

(1.郑州大学第一附属医院 检验科 河南 郑州 450052;2.郑州大学 公共卫生学院 河南 郑州450001)

目前世界各国对尘肺病进行了大量的研究，但尘肺病的发病机制仍然不十分明确［1-2］。近年来的研究表明，尘肺病肺纤维化发生发展的过程与机体免疫功能变化密切相关。尘肺患者的免疫系统能够感知自身细胞蛋白或多肽的异常表达，并使机体形成相应的自身抗体，这些自身抗体是与尘肺病发生相关的分子事件的感知者和应答者，是一种潜在的诊断尘肺病的生物标记物。课题组的前期研究应用抗体库技术成功筛选出人源尘肺病的6 种强阳性克隆抗体［3-4］，其中发现颗粒酶B(Granzyme B，GzmB)抗体在尘肺病的发生发展过程中具有一定作用。

此次研究采用人群流行病学调查研究，对煤工尘肺患者及接尘工人血清中GzmB 抗体的表达水平进行检测，探讨其与尘肺病的关系。

1 调查对象和方法

1.1 调查对象 选择调查对象1 260例，分为4 组，其中:观察对象组230例，为河南省诊断X 射线胸片已出现尘肺病变但尚未达到壹期尘肺的男性煤矿工人;接尘组309例，为同地区相同工作环境中正在接尘但X 射线胸片尚未出现尘肺病变表现的男性煤矿工人;病例组328例，为根据现行尘肺病X 线诊断标准(GBZ70-2009)确诊为煤工尘肺患者的同地区男性煤矿工人;健康对照组393例，为河南省某医院的男性健康体检者。所有研究对象均接受问卷调查，且均排除自身免疫病及其他肺部疾病。

1.2 研究方法 采用酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbent serologic assay，ELISA)法检测所有调查对象血清中GzmB 抗体的表达水平。

1.3 统计方法 采用Excel 建立数据库，应用SPSS 21.0统计软件对数据库进行统计分析，所有结果以(±s)表示，采用方差分析或t 检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 调查对象基本情况 调查对象共1 260例，其中观察对象组、煤工尘肺患组、接尘组和健康对照组分别有230例、328例、309例和393例)。调查对象的工龄、吸烟及饮酒史差异无统计学意义(P ＞0.05)。见表1。

表1 调查对象的基本情况

2.2 调查对象血清中GzmB 抗体的水平比较 由表2可见，煤工尘肺患者血清中GzmB 抗体表达水平高于接尘组，差异有统计学意义(P ＜0.05);煤工尘肺组血清中GzmB 抗体表达水平与对照组差异有统计学意义(P ＜0.05)。

2.3 煤工尘肺组内不同期别人群血清中GzmB 抗体表达水平的比较 3 组人员血清中GzmB 的表达水平差异均无统计学意义(P ＜0.05)。见表3。

表2 调查对象血清中GzmB 抗体表达水平的比较(±s)

表2 调查对象血清中GzmB 抗体表达水平的比较(±s)

注:与煤工尘肺比较* P ＜0.05。

分期 n OD值230 1.416±0.450煤工尘肺组 328 1.478±0.450接尘组 309 1.325±0.463*对照组 393 1.377±0.430*F 6.661 P观察对象组＜0.001

2.4 工龄对观察对象、煤工尘肺组不同期别GzmB抗体表达的影响 由于叁期尘肺病例数太少，故将贰期尘肺与叁期尘肺合并成为一组。将工种分为3 组，工龄按照中位数25年分为两组。对不同工龄的尘肺患者比较时发现，壹期尘肺组中，＜25年血清中GzmB抗体的表达低于≥25年组，且差异有统计学意义(P ＜0.05)。在工龄≥25年组中，观察对象组血清中GzmB抗体的表达低于壹期尘肺组，且差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表4。

表3 煤工尘肺组中不同期别人群血清GzmB 抗体表达水平(±s)

表3 煤工尘肺组中不同期别人群血清GzmB 抗体表达水平(±s)

分期 n OD值259 1.488± 0.451贰期尘肺 60 1.459± 0.446叁期尘肺 9 1.311± 0.423 F 0.739 P壹期尘肺0.478

表4 不同工龄血清GzmB 抗体表达水平的比较(±s)

表4 不同工龄血清GzmB 抗体表达水平的比较(±s)

注:与观察对象组中工龄＞25年组比较* P ＜0.05，与壹期尘肺组中工龄＜25年组比较P ＜0.05。

工龄观察对象组n OD 值壹期尘肺组n OD 值贰期和叁期尘肺组n OD 值F P 42 0.072 0.930≥25年 92 1.380±0.432 157 1.534±0.443* 36 1.458±0.449 3.589 0.029 t 0.993－2.026 0.357 P＜25年 138 1.440±0.461 102 1.418±0.457 33 1.420±0.4 0.322 0.044 0.722

3 讨论

GzmB 是自然杀伤细胞和细胞毒性T 淋巴细胞所分泌的，进入靶细胞后引起caspases 的链锁反应［5］，致使靶细胞DNA 的降解，从而介导细胞凋亡，GzmB 可通过3 种途径介导细胞凋亡，并且是其中重要的效应分子［6］。在肺纤维化发生时，成纤维细胞中α-SMA、ColⅠ和ColⅢ蛋白含量的增加，提示成纤维细胞正在向肌成纤维细胞转化，是纤维化发生的标志之一［7-8］。有研究［9］通过建立GzmB 抗体抑制大鼠矽肺模型，发现抑制组α-SMA、ColⅠ和ColⅢmRNA 和蛋白的表达水平显著高于空白组和二氧化硅处理组，提示抑制大鼠肺成纤维细胞GzmB 抗体，对二氧化硅致成纤维细胞激活具有抑制作用。

该研究通过ELISA 技术检测观察对象、煤工尘肺患者、接尘工人以及健康人群血清中GzmB 抗体的表达。结果显示，对照组人群与接尘工人血清中GzmB抗体的表达水平均低于煤工尘肺患者，并且差异具有统计学意义，且对照组、观察对象组和煤工尘肺组人群血清GzmB 抗体的表达逐渐增加。分析原因可能是由于在煤工尘肺的发生过程中，CTL 通过穿孔素/颗粒酶途径作用于吞噬粉尘颗粒或者被粉尘颗粒破坏的淋巴细胞、巨噬细胞及上皮细胞，并引起这些细胞DNA 降解，同时释放Fas 配体和炎症细胞因子，这些可溶性效应分子的释放能够激活中性粒细胞和淋巴细胞，诱导T 细胞活化增殖，参与机体的免疫反应，但也会破坏正常的肺巨噬细胞和上皮细胞并引起非特异性的淋巴细胞浸润肺组织。这些非特异的炎症细胞能加重CTL诱导的组织损伤并最终并加重纤维化反应。有研究通过建立穿孔素基因敲除小鼠肺纤维化模型，发现穿孔素基因敲除小鼠肺组织细胞凋亡数量明显少于野生型小鼠，说明穿孔素和GzmB 介导的凋亡反应与肺纤维化有一定联系［10］。此外张彬等［11］检测IL-2、IL-12 对NK-92 细胞系表达颗粒酶基因的影响发现IL-2、IL-12等Th1 型细胞因子可以上调NK-92 细胞中GzmB 基因转录水平，而在煤工尘肺病早期，矽尘进入肺内损伤和激活淋巴细胞、巨噬细胞等效应细胞，分泌大量的Th1型细胞因子，这都与研究发现相一致。

在对不同期别煤工尘肺患者血清中GzmB 抗体的表达分析时发现，虽然不同期别之间的差异无统计学意义，但患者血清中GzmB 抗体的表达随尘肺分期的增高有降低的趋势，推测可能与肺组织纤维化的严重程度有关。随着煤工尘肺的发生发展，当Th1 型细胞因子占劣势，Th2 型细胞因子占优势时，由于Th1 型细胞因子减少降低了颗粒酶B 的基因转录水平。同时由于肺组织纤维化的加重，细胞毒性T 细胞作用于肺正常细胞导致组织损伤的机制被抑制，因此患者血清中GzmB 抗体的表达逐渐减少。

在对工龄研究时发现粉尘接触史长的患者血清中GzmB 抗体的表达水平高于接触史较短的患者，差别有统计学意义。提示在煤工尘肺中，随着接尘时间的增加，GzmB 大量释放，导致淋巴细胞、巨噬细胞等效用细胞凋亡，加重肺纤维化，因此产生大量GzmB 抗体以抑制肺纤维化。

综上所述，煤工尘肺患者血清中GzmB 抗体表达水平增高且与接尘工龄正相关，提示GzmB 抗体可能通过参与了煤工尘肺的发生发展过程，具体机制需进一步验证。

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