Survivin和Bax蛋白在食管鳞癌组织中的表达及临床意义

吴小源，胡晓娜，贺春语，杨原源，郝大选，李 雪，王建华

(1.郑州大学附属肿瘤医院 放疗科 河南郑州 450008;2.河南省中医学院三附院 医学影像科 河南郑州 450008)

细胞凋亡是由Caspase半胱氨酸蛋白酶家族引发的级联反应的细胞自我破坏的程序性生化过程，对维持组织的正常形态结构和机体内环境稳定具有重要的作用，细胞凋亡出现异常最终会导致肿瘤的发生。Survivin和Bax是重要的细胞凋亡调控基因，与肿瘤的发生发展密切相关［1-2］。本研究通过免疫组织化学(SP)法检测Survivin和Bax蛋白在食管鳞癌组织中的表达，旨在探讨其与临床病理特征及预后的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集河南省肿瘤医院2007年10月至2009年8月临床资料完整的食管鳞状细胞癌(ESCC)病例58例，被检测的肿瘤标本均为石蜡包埋组织，其中手术标本50例，胃镜活检病理组织8例。男37例，女21例;年龄38～80岁，中位年龄63岁;高、中、低分别为19例、25例、14例;采用2009年AJCC食管癌分期标准进行分期，Ⅰ期6例，Ⅱ期37例，Ⅲ期15例;淋巴结转移24例，无淋巴结转移34例。所有患者均为初治，胃镜检查或手术前均未行放、化疗。

1.2 研究方法 所有标本均经10%甲醛固定，石蜡包埋，制成3 μm厚的切片，采用免疫组化SP法进行Survivin、Bax染色。Survivin兔抗人多克隆抗体、Bax鼠抗人单克隆抗体及免疫组化通用试剂盒均购自福州迈新公司。免疫组化染色按SP试剂盒操作说明进行，以微波修复法进行抗原修复，工作液浓度均为1∶150。

1.3 评定标准 Survivin和Bax阳性表达产物呈棕黄色细颗粒状，主要定位在细胞质。染色表达情况采用半定量法推算，按以下比例计分:肿瘤细胞染色阳性率为0%～4%计0分，5%～24%计1分，25%～49%计2分，50%～74%计3分，75%～100%计4分，染色强度用0(阴性)、1(弱阳性)和2(强阳性)来表示。各指标的表达水平用肿瘤细胞染色阳性率与染色强度评分的乘积表示，具体结果统计按 Krajewska等［3］推荐的方法进行。

1.4 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，不同临床病理特征间同一指标比较采用χ2检验，各指标相关性采用Spearman等级相关分析;绘制Kaplan-Meier生存曲线，生存差异采用log-rank方法进行比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Survivin、Bax蛋白在食管鳞癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系 Survivin和Bax蛋白阳性表达产物呈棕黄色颗粒位于食管鳞癌细胞质和细胞核中，以细胞质为主，其阳性表达率分别为77.6%(45/58)和43.1%(25/58)。Survivin蛋白在高、中、低分化食管鳞癌组织中的阳性表达率分别为63.2%、76.0%和100.0%，差异有统计学意义(P=0.042)，而与性别、年龄、浸润深度、淋巴结转移和临床分期无关(P＞0.05)。Bax蛋白的表达与性别、年龄、浸润深度、淋巴结转移、临床分期及分化程度均无关(P＞0.05)。见表1。

表1 Survivin和Bax蛋白的表达与临床病理特征的关系(n，%)

2.2 Survivin、Bax蛋白在食管鳞癌组织中表达的相关性 采用Spearman等级相关分析评价Survivin和Bax蛋白在食管鳞癌组织中表达的相关性，结果显示Survivin和Bax蛋白的表达无相关性(r=0.134，P=0.316)，见表2。

表2 Survivin和Bax蛋白表达的相关性(n)

2.3 Survivin、Bax蛋白对食管鳞癌预后的影响 全组58例食管鳞癌患者均完成随访，末次随访时间为2014年8月31日。全组1、3、5年生存率为93.1%、46.6%和27.5%，中位生存时间34.5个月。Survivin蛋白阳性组与阴性组患者的1、3、5年生存率分别为95.6%、46.7%、28.7%和84.6%、46.2%、23.1%，中位生存时间分别为35.2个月和26.6个月(P=0.560)(见图1)。Bax蛋白阳性组与阴性组患者的1、3、5年生存率分别为92.0%、44.0%、24.0%和93.9%、48.5%、30.3%，中位生存时间分别为25.5 个月和35.6 个月(P=0.330)(见图2)。

图1 Survivin蛋白阳性组与阴性组预后比较

3 讨论

图2 Bax蛋白阳性组与阴性组预后比较

食管癌是人类常见的恶性肿瘤，恶性程度高，预后差，其发生发展与细胞增殖、细胞凋亡的失衡密切相关。细胞凋亡是由Caspase半胱氨酸蛋白酶家族引发的级联反应的细胞自我破坏的程序性生化过程，对维持组织的正常形态结构和机体内环境稳定具有重要的作用，受多种细胞凋亡相关基因的调控。Survivin是凋亡抑制蛋白(IAP)家族成员之一，也是迄今发现的作用最强的凋亡抑制因子。Survivin通过特异性地与Caspase-3和Caspase-7结合，抑制有活性的半胱天冬蛋白酶形成，从而发挥强大的抗凋亡作用，同时具有促进细胞增殖、参与细胞周期调控及促进血管生成多方面的功能。理论上，Survivin在肿瘤细胞中表达越强，肿瘤细胞的恶性程度越高，局部浸润和远处转移的能力越强，从而导致患者生存期缩短，死亡率增高。

Survivin的表达具有组织选择性，在胚胎组织和大多数人类肿瘤组织中都有表达，但在分化成熟的组织无表达。本研究中，Survivin在食管鳞癌组织中的阳性表达率为77.6%，与国内程道博等［4］的报道接近，提示Survivin可能对食管癌的早期诊断具有潜在价值。Muzio等［5］报道在浸润性鳞癌中，Survivin的表达和肿瘤分化程度、肿瘤大小及淋巴结转移相关。Cao等［6］对108例食管鳞癌患者外周血中Survivin的表达情况进行研究，结果显示循环血液中Survivin表达与肿瘤侵犯深度、血管侵犯、淋巴结转移和肿瘤分期均相关(P＜0.05)。本研究中，高、中、低分化食管鳞癌的Survivin 阳性表达率分别为63.2%、76.0%和100.0%，差异有统计学意义(P＜0.05)，与程道博［4］的报道一致。同时发现，淋巴结阳性组的Survivin表达率高于淋巴结阴性组，随着肿瘤侵犯深度及临床分期的升高，Survivin的阳性表达率也逐渐提高，但均无统计学差异，考虑与样本量小有关。本研究未发现Survivin的表达与患者的性别和年龄有关，与曹富民等［7］的结果一致。Ikeguchi等［8］在对53例食管鳞癌患者的研究中发现，17例Survivin mRNA高表达者与36例Survivin mRNA低表达者的5年生存率分别为14.1%和46.8%(P=0.001 8)，结论为Survivin mRNA的表达是独立于分期之外评估食管癌预后的一个良好生物指标。Cao等［6］发现循环血液中Survivin阳性患者肿瘤复发率高，生存率低，认为术后监测食管癌患者的Survivin表达情况可作为肿瘤复发的预测标志。但本研究中，Survivin蛋白阳性组与阴性组患者的1、3、5年生存率分别为95.6%、46.7%、28.7%和84.6%、46.2%、23.1%，中位生存时间分别为35.2个月和26.6个月，差异无统计学意义(P＞0.05)。

Bax是原癌基因Bcl-2家族的一员，其编码的蛋白21%与Bcl-2同源，生物学作用是拮抗Bcl-2基因，促进细胞凋亡。当Bax在细胞内过表达时，细胞对死亡信号的反应增强，细胞死亡增多［9］。目前关于Bax在食管癌中的表达及作用仍存在争议［10-14］。Kang等［12］报道Bax在食管癌中的高表达率为67.0%(42/63)，与放化疗后的临床完全缓解率密切相关，而与年龄、分期等无关，单因素分析显示Bax低表达与预后不良密切相关(P=0.000 8)，多因素分析认为Bax低表达是局部进展期食管癌预后不良的最强独立因子(P=0.009)。Kurabayashi等［13］报道，Bax 在食管鳞癌中的阳性表达率为82.9%(63/76)，与性别、年龄、肿瘤侵犯深度、血管侵犯、淋巴结转移和临床分期均无关，Bax阴性组的生存反而优于Bax阴性组(P=0.043)。本研究中，Bax在食管鳞癌组织中的阳性表达率为43.1%，其表达与患者性别、年龄、肿瘤侵犯深度、分化程度、淋巴结转移及临床分期均无关，Bax蛋白阳性组与阴性组患者的1、3、5年生存率无显著性差异(P=0.330)，与Natsugoe等［14］的研究结果相似。考虑造成Bax蛋白在食管癌中的表达程度及其作用不完全相同甚至完全相反的原因可能与样本大小、病例选择、实验方法及判断标准不同有关，亦有可能是Bax在食管癌的不同阶段所起的作用不同造成的。

Survivin和Bax在肿瘤的发生发展过程中的作用不同，是一对作用相反的凋亡抑制与促进基因，两者之间的平衡对细胞凋亡有重要作用。本研究中，Bax表达阳性及阴性的食管鳞癌组织中，Survivin阳性表达率均无显著性差异(r=0.134，P=0.316)，提示 Survivin和Bax基因可能通过各自不同的机制参与食管鳞癌的发生发展。

综上所述，Survivin蛋白在食管鳞癌组织中呈高表达状态，与食管鳞癌的分化程度密切相关，可能在食管鳞癌的发展过程中起重要作用，有待大样本临床研究来进一步验证。

［1］贾百灵，李继昌.胃腺癌发生过程中Fas、Bax蛋白表达的变化［J］.河南医学研究，1999，8(1):21-23.

［2］石敏.Survivin与肿瘤［J］.河南医学研究，2004，13(2):187.

［3］Krajewska M，Krajewski S，Epstein J I，et al.Immunohistochemical analysis of bcl-2，bax，bcl-X，and mcl-1 expression in prostate cancers［J］.The American journal of pathology，1996，148(5):1567.

［4］程道博，何巧玉，汲振余，等.Survivin在不同分化状态的食管鳞癌组织及体外食管鳞癌细胞中的表达［J］.河南医学研究，2010，19(1):27-29.

［5］Lo M L，Staibano S，Pannone G，et al.Expression of the apoptosis inhibitor survivin in aggressive squamous cell carcinoma［J］.Experimental and molecular pathology，2001，70(3):249-254.

［6］Cao M，Yie S M，Wu S M，et al.Detection of survivin-expressing circulating cancer cells in the peripheral blood of patients with esophageal squamous cell carcinoma and its clinical significance［J］.Clinical＆ experimental metastasis，2009，26(7):751-758.

［7］曹富民，张祥宏，严霞，等.食管鳞癌组织中survivin和caspase-3表达的预后意义及其与热休克蛋白表达的关系［J］.中华肿瘤杂志，2005，27(7):416-416.

［8］Ikeguchi M，Kaibara N.Survivin messenger RNA expression is a good prognostic biomarker for oesophageal carcinoma［J］.British journal of cancer，2002，87(8):883-887.

［9］Kagawa S，Gu J，Swisher S G，et al.Antitumor effect of adenovirusmediated Bax gene transfer on p53-sensitive and p53-resistant cancer lines［J］.Cancer research，2000，60(5):1157-1161.

［10］Sturm I，Petrowsky H，Volz R，et al.Analysis of p53/BAX/p16ink4a/CDKN2 in esophageal squamous cell carcinoma:High BAX and p16ink4a/CDKN2 identifies patients with good prognosis［J］.Journal of clinical oncology，2001，19(8):2272-2281.

［11］Sarbia M，Stahl M，Fink U，et al.Expression of apoptosis-regulating proteins and outcome of esophageal cancer patients treated by combined therapy modalities［J］.Clinical cancer research，1998，4(12):2991-2997.

［12］Kang S Y，Han J H，Lee K J，et al.Low expression of Bax predicts poor prognosis in patients with locally advanced esophageal cancer treated with definitive chemoradiotherapy［J］.Clinical cancer research，2007，13(14):4146-4153.

［13］Kurabayashi A，Furihata M，Matsumoto M，et al.Expression of Bax and apoptosis-related proteins in human esophageal squamous cell carcinoma including dysplasia［J］.Modern Pathology，2001，14(8):741-747.

［14］Natsugoe S，Matsumoto M，Okumura H，et al.Bax and Bcl-X expression are not related to prognosis in patients with advanced esophageal squamous cell carcinoma［J］.Cancer letters，2001，174(1):91-97.