虾夷马粪海胆不同肠道中菌群组成及其PCR—DGGE图谱分析

张璠等

摘要：利用细菌16S rDNA PCR-DGGE指纹图谱技术，对虾夷马粪海胆不同肠道的微生物菌群组成进行分析，结果表明：海胆小肠与大肠样品分别得到14条与13条条带，其中，共有条带为10条，优势条带分别为7条与5条，特异性条带分别为4条与3条；经后续条带比较分析和DGGE图谱割胶测序后发现，小肠与大肠样品中微生物主要来源于外界海水环境，其菌群构成存在差异与虾夷马粪海胆消化巨藻存在不同有关。

关键词：虾夷马粪海胆；肠道；16S rDNA；PCR-DGGE指纹图谱

中图分类号： S917.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0043-02

收稿日期：2013-11-22

基金项目：国家“863”计划 （编号：2012AA052103）；天津市科技支撑计划（编号：12ZCZDSFO2000、12ZCZDSY12300）。

作者简介：张璠（1989—），女，天津人，硕士，从事兽医微生物研究。E-mail：532637158@qq.com。

通信作者：李德茂。E-mail：zhangfan89@163.com。近年来，随着化石燃料资源日趋减少及空气污染问题逐渐加重，可再生能源已成为世界研究热点。藻类具有资源丰富、生长迅速等优势，是一种重要的潜在生物质能源资源[1]；但是，藻类细胞壁结构复杂且难以降解[2]，大大阻碍了藻类胞内生物能向化学能的转变[3]，因此生产中迫切需要一种成本低廉且高效降解巨藻的方法。虾夷马粪海胆（Strongylocentyotus internedius）喜食藻类，可利用肠道微生物水解酶来水解结构致密且多层的藻类细胞壁，达到释放藻类细胞内容物并吸收营养物质的目的[4]，这类生物降解一般需要多种微生物协同完成，绝非一个简单过程。虾夷马粪海胆肠道结构复杂，紧贴于体腔壁难以剥离，因此关于其肠道中微生物构成及功能的研究甚少[5]。本试验采用PCR-DGGE技术，以16S rDNA作为分子标记，对海胆不同肠道的微生物菌群组成进行分析，探究不同海胆肠道微生物在巨藻（Macrocystis pyrifera）消化过程中的关系，为海胆肠道菌群动态研究，以及体外模拟海胆肠道微生物降解巨藻以提高其胞内物质的化学能利用提供依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1原料虾夷马粪海胆购买于大连太平洋海珍品有限公司；巨藻采购于青岛明月海藻集团有限公司。

1.1.2主要试剂 TIANamp Stool DNA Kit，由天根生化科技有限公司生产；UNIQ-10柱式细菌基因组抽提试剂盒，由上海生工生物工程有限公司生产；大量DNA产物纯化试剂盒，由天根生化科技有限公司生产。

1.2样品的处理

取形态大小正常且均一的健康海胆10只，在超净工作台上用70%乙醇清洗海胆表面3次；使用无菌剪刀由海胆排泄孔方向环形剪开，用手术刀轻轻剥离海胆性腺与内脏，将肠道完全剥离到无菌的工作盘中并清楚分段；取小肠液与大肠中的食物残渣，装入2 mL无菌离心管中备用。

1.3肠道DNA的提取

使用TIANamp Stool DNA Kit提取海胆大肠微生物DNA。

1.416S rDNA V3区的扩增

1.5DGGE指纹图谱的构建

使用D Code 2000 System（Bio-Rad）进行PCR-DGGE电泳。变性凝胶制备电泳条件为：10%聚丙烯酰胺，浓度范围在30%～55%；上样量为20 μL，电压65 V，温度60 ℃，电泳时间16 h。染色方法为银染。

2结果与分析

2.1海胆肠道中细菌16S rDNA V3区PCR扩增

将从海胆大肠、小肠中提取的微生物总DNA进行16S rDNA V3区PCR扩增，在230 bp左右处可见清晰且单一的条带（图1）。这表明经扩增后的16S rDNA V3区片段纯度符合PCR-DGGE要求，可以利用16S rDNA V3区片段作为分子标记构建DGGE图谱。

2.216S rDNA V3区DGGE指纹图谱的构建与海胆肠内细菌组成分析

由图2、表1可见，海胆小肠与大肠样品细菌总DNA由16S rDNA V3区扩增后经PCR-DGGE电泳， 分别得到14条

与13条条带，两者条带总数较为单一；海胆小肠样品优势条带为7条，分别为X1～X4、X7、X10和X14，其中，5种为海洋嗜冷单胞菌属（Psychromonas sp.）细菌，2种为希瓦氏菌属（Shewanella sp.）细菌；大肠样品优势条带为5条，分别为 D1～D4、D12，其中，4种属于嗜冷单胞菌属细菌，1种为希瓦氏菌属细菌；海胆小肠与大肠中特异性条带分别为X5～X7、X9和D5、D6、D9，其中，小肠中3个条带为海洋嗜冷单胞菌属菌，1个为希瓦氏菌属菌，而大肠中特异条带均为希瓦氏菌

属菌。这说明海胆不同肠道中微生物类群组成存在差异。表1小肠DGGE条带聚类分析结果

部位条带号细菌种类相似度（%）登录号小肠X1～X5、X8、X9、X14海洋嗜冷单胞菌属（Psychromonas sp.）94～97NC_020802.1X6非培养细菌（Uncultured bacterium）——X7、X10～X13希瓦氏菌属（Shewanella sp.）100NC_008577.1大肠D1～D4、D7、D13 海洋嗜冷单胞菌属（Psychromonas sp.）94～98NC_020802.1D5、D6、D8～D12希瓦氏菌属（Shewanella sp.）99NC_008577.1

3结论与讨论

海胆体腔为一个相对密闭的空间，正常海胆体内微生物数量远少于外界环境[6]，同时，PCR-DGGE过程存在技术限制，不同微生物DNA可能会发生条带共迁移，低丰度的菌群较难检测出来[7]，造成DGGE图谱条带数量较少。这一现象与虾夷马粪海胆体腔中微生物研究结果较为相似。

海洋嗜冷单胞菌属微生物在海水中普遍存在，可分泌嗜冷酶[8]，这类酶最适反应温度较低，可长时间维持稳定的活性且作用广泛。目前，已从海水中分离出具纤维素酶与脂肪酶活性的嗜冷酶[9]，而纤维素与脂肪同样也是巨藻的主要营养成分[10]。虾夷马粪海胆中海洋嗜冷单胞菌属微生物的出现，在一定程度上也说明海洋嗜冷单胞菌属微生物在海胆消化巨藻过程中起到不可忽略的作用。希瓦氏菌属微生物常在皱纹鲍及海虾等海洋生物中被发现[11-12]，该菌属中某些细菌可分泌多糖类与多不饱和脂肪酸等物质，为海洋生物提供营养[13]，并在海洋动物生长过程中与肠道内的有害微生物形成拮抗关系[14]，起到抑制病原菌生长、提高机体免疫力的作用。因此，从试验结论看，海胆肠道菌中的海洋嗜冷单胞菌属和希瓦氏菌属菌有可能来源于海洋环境，并在海胆消化巨藻及生长发育过程中起到重要作用。

海胆肠道中，小肠优势菌群数量比大肠丰富，这可能是由于在海胆消化过程中，食物首先经过小肠，造成大部分附着在食物上的微生物随之进入小肠所致。在试验过程中，某些小肠样品DGGE图谱条带在大肠样品中观测不到，这一结果与海参肠道的研究[15]相似，这也说明了海胆肠道对微生物具有一定的选择调节作用。另外，小肠中的海洋嗜冷单胞菌属菌相对大肠来说，为主要的特异菌群，其对巨藻的降解能力较强，可能对巨藻前期消化起到一定作用；大肠中的特异菌群为希瓦氏菌属菌，可有效帮助海胆体进一步吸收营养物质，并抑制大肠中有害微生物的产生。

总之，海胆肠道微生物是在进食过程获得，通过机体自身作用对肠道微生物进行选择与调节达到菌群的动态平衡，并利用相对密闭的体腔空间来维持肠道内微生物数量的稳定。在海胆消化过程中，不同肠道中的微生物消化分工有所不同，小肠中海洋嗜冷单胞菌属菌对巨藻进行前期消化，大肠希瓦氏菌属菌对巨藻营养进行吸收调节。海胆肠道中微生物群类差异与海胆肠道功能密切相关，其优势微生物差异性将是了解海胆摄食、揭示肠道微生物协同降解巨藻机理的关键所在。

参考文献：

[1]肖波，周英彪，李建芬.生物质能循环经济技术[M]. 北京：化学工业出版社，2006.

[2]Drews G，Weckesser J. Function，structure and composition of cell walls and external layers [Algae，cyanobacteria][J]. Botanical monographs，1982，19（1）：28-29.

[3]Ke J，Laskar D D，Singh D，et al. In situ lignocellulosic unlocking mechanism for carbohydrate hydrolysis in termites：crucial lignin modification[J]. Biotechnology for Biofuels，2011，4（1）：1-12.

[4]Ziegler A，Mooi R，Rolet G，et al. Origin and evolutionary plasticity of the gastric caecum in sea urchins （Echinodermata：Echinoidea）[J]. BMC Evolutionary Biology，2010，10（6）：313.

[5]李伟，张付云，孙秋颖，等. 海胆及其共附微生物的活性物质研究进展[J]. 食品研究与开发，2010，31（9）：202-206.

[6]王轶南，刘艳萍，常亚青. 患病与健康虾夷马粪海胆（Strongylocentrotus intermedius）体腔液菌群的PCR-DGGE分析比较[J]. 中国农业科技导报，2011，13（1）：111-116.

[7]刘丹，凌云. PCR-DGGE实验过程中常见问题的分析与改进[J]. 湖南农业科学，2010，24（24）：26-27.

[8]王玢，汪天虹，张刚，等. 产低温纤维素酶海洋嗜冷菌的筛选及研究[J]. 海洋科学，2003，27（5）：42-45.

[9]郝建华，孙谧，王跃军，等. 产脂肪酶海洋嗜冷菌的鉴定及酶学性质研究[J]. 高技术通讯，2008，18（7）：748-753.

[10]纪明侯. 海藻化学[M]. 北京：科学出版社，1997.

[11]罗璋. 斑点叉尾肠道益生菌的筛选与特性研究[D]. 武汉：华中农业大学，2007.

[12]冷晓飞，姜海峰，刘小林，等. 皱纹盘鲍肠道菌群组成及 PCR-DGGE 指纹图谱分析[J]. 海洋科学，2013，37（5）：10-14.

[13]Weiner R M，Walch M，Labare M P，et al. Effect of biofilms of the marine bacterium Alteromonas colwelliana （LST） on set of the oysters Crassostrea gigas （Thunberg，1793） and C. virginica （Gmelin，1791）[J]. Journal of Shellfish Research，1989，8（1）：117-123.

[14]Vinderola G，Matar C，Perdigon G. Role of intestinal epithelial cells in immune effects mediated by gram-positive probiotic bacteria：Involvement of Toll-like receptors[J]. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology，2005，12（9）：1075-1084.

[15]孙奕，陈騳. 刺参体内外微生物组成及其生理特性的研究[J]. 海洋与湖沼，1989，20（4）：300-307.李晓君，王绍梅，谢艳兰，等. 农杆菌渗透法转化烟草条件的优化[J]. 江苏农业科学，2014，42（9）

：45-47.

海洋嗜冷单胞菌属微生物在海水中普遍存在，可分泌嗜冷酶[8]，这类酶最适反应温度较低，可长时间维持稳定的活性且作用广泛。目前，已从海水中分离出具纤维素酶与脂肪酶活性的嗜冷酶[9]，而纤维素与脂肪同样也是巨藻的主要营养成分[10]。虾夷马粪海胆中海洋嗜冷单胞菌属微生物的出现，在一定程度上也说明海洋嗜冷单胞菌属微生物在海胆消化巨藻过程中起到不可忽略的作用。希瓦氏菌属微生物常在皱纹鲍及海虾等海洋生物中被发现[11-12]，该菌属中某些细菌可分泌多糖类与多不饱和脂肪酸等物质，为海洋生物提供营养[13]，并在海洋动物生长过程中与肠道内的有害微生物形成拮抗关系[14]，起到抑制病原菌生长、提高机体免疫力的作用。因此，从试验结论看，海胆肠道菌中的海洋嗜冷单胞菌属和希瓦氏菌属菌有可能来源于海洋环境，并在海胆消化巨藻及生长发育过程中起到重要作用。

海胆肠道中，小肠优势菌群数量比大肠丰富，这可能是由于在海胆消化过程中，食物首先经过小肠，造成大部分附着在食物上的微生物随之进入小肠所致。在试验过程中，某些小肠样品DGGE图谱条带在大肠样品中观测不到，这一结果与海参肠道的研究[15]相似，这也说明了海胆肠道对微生物具有一定的选择调节作用。另外，小肠中的海洋嗜冷单胞菌属菌相对大肠来说，为主要的特异菌群，其对巨藻的降解能力较强，可能对巨藻前期消化起到一定作用；大肠中的特异菌群为希瓦氏菌属菌，可有效帮助海胆体进一步吸收营养物质，并抑制大肠中有害微生物的产生。

总之，海胆肠道微生物是在进食过程获得，通过机体自身作用对肠道微生物进行选择与调节达到菌群的动态平衡，并利用相对密闭的体腔空间来维持肠道内微生物数量的稳定。在海胆消化过程中，不同肠道中的微生物消化分工有所不同，小肠中海洋嗜冷单胞菌属菌对巨藻进行前期消化，大肠希瓦氏菌属菌对巨藻营养进行吸收调节。海胆肠道中微生物群类差异与海胆肠道功能密切相关，其优势微生物差异性将是了解海胆摄食、揭示肠道微生物协同降解巨藻机理的关键所在。

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[15]孙奕，陈騳. 刺参体内外微生物组成及其生理特性的研究[J]. 海洋与湖沼，1989，20（4）：300-307.李晓君，王绍梅，谢艳兰，等. 农杆菌渗透法转化烟草条件的优化[J]. 江苏农业科学，2014，42（9）

：45-47.

海洋嗜冷单胞菌属微生物在海水中普遍存在，可分泌嗜冷酶[8]，这类酶最适反应温度较低，可长时间维持稳定的活性且作用广泛。目前，已从海水中分离出具纤维素酶与脂肪酶活性的嗜冷酶[9]，而纤维素与脂肪同样也是巨藻的主要营养成分[10]。虾夷马粪海胆中海洋嗜冷单胞菌属微生物的出现，在一定程度上也说明海洋嗜冷单胞菌属微生物在海胆消化巨藻过程中起到不可忽略的作用。希瓦氏菌属微生物常在皱纹鲍及海虾等海洋生物中被发现[11-12]，该菌属中某些细菌可分泌多糖类与多不饱和脂肪酸等物质，为海洋生物提供营养[13]，并在海洋动物生长过程中与肠道内的有害微生物形成拮抗关系[14]，起到抑制病原菌生长、提高机体免疫力的作用。因此，从试验结论看，海胆肠道菌中的海洋嗜冷单胞菌属和希瓦氏菌属菌有可能来源于海洋环境，并在海胆消化巨藻及生长发育过程中起到重要作用。

海胆肠道中，小肠优势菌群数量比大肠丰富，这可能是由于在海胆消化过程中，食物首先经过小肠，造成大部分附着在食物上的微生物随之进入小肠所致。在试验过程中，某些小肠样品DGGE图谱条带在大肠样品中观测不到，这一结果与海参肠道的研究[15]相似，这也说明了海胆肠道对微生物具有一定的选择调节作用。另外，小肠中的海洋嗜冷单胞菌属菌相对大肠来说，为主要的特异菌群，其对巨藻的降解能力较强，可能对巨藻前期消化起到一定作用；大肠中的特异菌群为希瓦氏菌属菌，可有效帮助海胆体进一步吸收营养物质，并抑制大肠中有害微生物的产生。

总之，海胆肠道微生物是在进食过程获得，通过机体自身作用对肠道微生物进行选择与调节达到菌群的动态平衡，并利用相对密闭的体腔空间来维持肠道内微生物数量的稳定。在海胆消化过程中，不同肠道中的微生物消化分工有所不同，小肠中海洋嗜冷单胞菌属菌对巨藻进行前期消化，大肠希瓦氏菌属菌对巨藻营养进行吸收调节。海胆肠道中微生物群类差异与海胆肠道功能密切相关，其优势微生物差异性将是了解海胆摄食、揭示肠道微生物协同降解巨藻机理的关键所在。

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