多菌灵及其杂质和代谢物对赤子爱胜蚯蚓的急性毒性和遗传毒性

郇志博 罗金辉

摘 要 分别使用土壤培养法和血细胞微核试验测定多菌灵及其杂质（2，3-二氨基酚嗪和2-氨基-3-羟基酚嗪）和代谢物（2-氨基苯并咪唑）对赤子爱胜蚯蚓的急性毒性和遗传毒性。结果表明：多菌灵、2，3-二氨基酚嗪和2-氨基-3-羟基酚嗪和2-氨基苯并咪唑对赤子爱胜蚯蚓7 d的LC50分别为8.60、14.84、18.92和27.72 mg/kg干土，多菌灵对蚯蚓的毒性为中毒，其他3种化合物为低毒。微核试验结果表明：多菌灵能明显诱导赤子爱胜蚯蚓血细胞产生微核，并且随着暴露剂量和暴露时间的延长微核率增加；其他3种物质在测定剂量和测定时间下，微核率与空白对照差异不显著。

关键词 多菌灵 ；2，3-二氨基酚嗪 ；2-氨基-3-羟基酚嗪 ；2-氨基苯并咪唑 ；急性毒性 ；遗传毒性

分类号 X171.5

多菌灵是一种内吸性苯并咪唑类杀菌剂，常用于防治多种真菌性病害，如炭疽病、霜霉病、锈病、疮痂病、褐斑病等，在果蔬、茶叶和观赏植物上广泛应用[1]。中国年产多菌灵原药超过1万 t，占中国杀菌剂总量的1/4[2]。截止2012年7月， 中国共有857家农药厂登记各种多菌灵的单一及复配制剂，且多菌灵还是其他苯并咪唑类杀菌剂（如：苯菌灵、噻菌灵和托布津等）的活性成分和代谢产物[3]，多菌灵降解速度缓慢，在土壤中培养250 d后，仍会有5%～13%的多菌灵残存于土壤中[4]，而且多菌灵在水果、蔬菜中残留超标的情况也时有发生[5-6]。

2012年1月，美国可口可乐公司和百事公司的橙汁产品检出极少量杀菌剂多菌灵，由于多菌灵可疑的损伤遗传物质的作用，引起全球范围的“果汁”恐慌[7]。2012年4月国际环保组织“绿色和平”调查北京、成都和海口的9个茶叶品牌，检测结果发现18份茶叶有14份含有多菌灵等可能影响生育能力、胎儿发育或可能损害遗传基因的残留农药[8]。

20世纪80年代就有关于多菌灵的毒性报道，至90年代，多菌灵已被世界卫生组织列为可疑的环境内分泌干扰物。多菌灵的大鼠急性经口LC50>15 000 mg/kg，经皮LC50>2 000 mg/kg，小鼠口服LC50为5 000 mg/kg，按中国农药毒性分级标准属于低毒杀菌剂[9]。但多菌灵是否具有遗传毒性，众说纷纭。有学者研究发现，长期大量喂食含多菌灵的饲料可以提高小鼠肝脏良、恶性肿瘤的发病率，且与给药量有着明显的剂量-反应关系；另一些学者却研究发现，多菌灵可能不是一种致突变物，因为给大鼠喂食含1 000 mg/kg多菌灵的饲料4个月，结果显示为阴性[9]。曹柳燕等[10]研究发现，多菌灵的致癌性与杂质2，3-二氨基酚嗪（DAP）和2-氨基-3-羟基酚嗪（HAP）有关，通过改善多菌灵的生产工艺，可以减少杂质含量，降低多菌灵的遗传毒性；于功昌等[9]认为，多菌灵的致癌性与其代谢转化产物（2-氨基苯并咪唑）有关。因此，弄清多菌灵是否具有遗传毒性以及其遗传毒性与杂质和代谢物的关系，对保护消费者的健康和保障食品安全具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试动物和药剂

赤子爱胜蚯蚓（Eisenia foetida）购自天津贾立明养殖公司，每条体重约200～300 mg，经实验室预培养，环带明显、大小基本一致的健康成蚓，试验前清肠24 h。

多菌灵、2，3-二氨基酚嗪（DAP）、2-氨基-3-羟基酚嗪（HAP）和2-氨基苯并咪唑标准品购自SIGMA公司。

1.1.2 试验设备和条件

光学显微镜（YS100，尼康）；光照培养箱（HPG-280B，哈尔滨东联电子技术开发有限公司）。

试验用人工土壤由10%泥炭藓、20%高岭土、68%石英砂和2%碳酸钙组成，充分混匀后待用。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性试验

参照刘伟等[11]的研究方法，先做预试验，求出各种化合物对蚯蚓7 d全致死的最低浓度和全存活的最高浓度，在此范围内设置5个处理组，设立溶剂对照和空白对照，每个处理3个重复，每个重复10条蚯蚓。先将丙酮配制的系列浓度的化合物与10 g人工土壤混匀，待丙酮充分挥发后，再与490 g人工土壤充分混匀，调节水分，使其含水量约为30%，然后放入蚯蚓，置于2 L烧杯中，用塑料薄膜封口，并用解剖针在薄膜上扎孔，置（20±1）℃、湿度80%～85%的培养箱中，400～800 Lx光强连续光照，于第7天倒出瓶内土壤，记录蚯蚓死亡数（用针轻触蚯蚓尾部，蚯蚓无反应则为死亡），及时清除死蚯蚓。根据蚯蚓7 d的死亡率，求出各个化合物对蚯蚓的急性毒性LC50值及95%置信限。

1.2.2 微核试验

根据急性毒性试验各个化合物的LC50值，设置多菌灵试验浓度为0.4、1.2、3.6 mg/kg干土；2，3-二氨基酚嗪浓度、2-氨基-3-羟基酚嗪浓度为0.6、1.8、5.4 mg/kg干土；2-氨基苯并咪唑浓度为0.8、2.4、7.2 mg/kg干土。设置空白（水）对照、阳性对照（丝裂霉素）0.4 mg/kg干土，染毒方法同急性毒性试验方法，于处理后的第7、14、21天取出蚯蚓，制备血细胞涂片并进行显微观察，每个处理设3个重复，每个重复10条蚯蚓。

将染毒后的蚯蚓浸入蒸馏水中并逐滴加入浓度为95%酒精，使蚯蚓麻醉，然后用滤纸吸干多余液体，用小剪刀将蚯蚓的背部剪破后取血，迅速涂片，晾干，甲醇固定15 min，15% Giemsa染色液（用0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液稀释，pH 6.8）染色15 min，用去离子水冲洗，电热吹风吹干，400倍显微镜观察。每个重复取2条蚯蚓，每条蚯蚓制备1张涂片，每张涂片观察约500个血细胞，记录微核细胞数目，计算微核率，观察结果以千分率表示。微核判断标准：位于有核血细胞胞浆中，与主核完全分开，呈圆形或椭圆形蓝紫色颗粒，边缘光滑，染色性质与主核一致，大小为主核的1/3以下[12]。

1.2.3 数据处理

根据不同浓度下的死亡率，使用软件SPSS16.0的Probit模型计算各个化合物对蚯蚓的急性毒性LC50值及95%置信限；微核率的结果表示为[平均值±标准偏差（SD）]，使用SPSS的单因素方差分析法分析不同浓度处理区组间差异，若差异明显，用SPSS的最小显著极差法（LSD）进行多重比较。

2 结果与讨论

2.1 4种物质对蚯蚓的急性毒性

4种物质土壤染毒后蚯蚓的中毒症状类似：低浓度下，体色变暗，卷曲、僵硬，生殖环肿胀，高浓度处理后蚯蚓背部出现水泡、渗血现象，随着中毒时间延长，高浓度处理组蚯蚓渗血现象严重，生殖环溃烂，体节延长，蚯蚓尾部有断节现象。

蚯蚓是评价化学农药安全性的一种重要的指示生物。目前中国划定的农药对蚯蚓毒性等级标准为高毒（LC50≤1 mg/kg干土），中毒（1 mg/kg干土10 mg/kg干土）（《化学农药环境安全评价试验准则》）。由表1可知，多菌灵LC50为8.60 mg/kg干土为中毒，2，3-二氨基酚嗪LC50为14.84 mg/kg干土为低毒，2-氨基-3-羟基酚嗪LC50为18.92 mg/kg干土为低毒，2-氨基苯并咪唑LC50为27.72 mg/kg干土为低毒。

2.2 微核试验

表2数据表明，随着多菌灵浓度的升高，在相同的染毒时间内，蚯蚓血细胞的微核率显著性升高。在同一浓度下，随着染毒时间的延长，蚯蚓血细胞的微核率也有所提高（P<0.05），空白对照和阳性对照的试验结果表明试验数据可信。通过400倍的显微镜观察，多菌灵诱导的蚯蚓血细胞微核清晰可见（图1）。表2、3和4表明，多菌灵的2种杂质2，3-二氨基酚嗪（DAP）和2-氨基-3-羟基酚嗪（HAP）和1种代谢物2-氨基苯并咪唑对蚯蚓血细胞微核的诱导作用与空白对照相比差异不显著（P>0.05），而且随着处理时间的延长，其微核率与空白对照相比差异也不显著（P>0.05）。

3 结论

微核是细胞经辐射或化学药物的作用后，在有丝分裂过程中形成的落后染色体、染色体桥、染色断片、环状染色体等在末期以后形成的1个或几个规则的次核。一般产生的微核数与外界诱变因子的强弱成正比，所以可用微核出现的千分率来评价污染物对生物遗传物质影响的程度，微核率已被国际诱变剂、致癌剂保护委员会推荐为检查致癌剂、诱变剂常用的遗传毒理方法之一[13]。

至于多菌灵诱导产生微核的机理，黎杰强等[13]通过蚕豆微核试验发现，多菌灵一是通过干扰有丝分裂过程中纺锤体的形成，引起细胞不能正常有丝分裂，致使一到数条染色体在有丝分裂后期不能进入细胞核，而单独留在细胞质中形成微核；二是多菌灵直接导致染色体断裂和粘连。吴丽明等[14]通过对雄性小鼠生殖细胞的染色体观察发现，多菌灵能诱发小鼠精母细胞染色体畸变率增加，畸变的类型有形成染色体断片、环状四价体和链状四价体等。

本研究表明：多菌灵对赤子爱胜蚯蚓的毒性等级为中毒，杂质（2，3-二氨基酚嗪和2-氨基-3-羟基酚嗪）和代谢物（2-氨基苯并咪唑）对赤子爱胜蚯蚓为低毒；多菌灵能明显诱导赤子爱胜蚯蚓血细胞产生微核，并且随着暴露剂量和暴露时间的延长微核率增加，因此多菌灵是一种潜在的诱变剂和致癌剂；建议目前的食品安全风险评估在关注农药残留的急性毒性的同时，加强关注多菌灵类似农药的诱变作用和致癌作用；另外杂质（2，3-二氨基酚嗪和2-氨基-3-羟基酚嗪）和代谢物（2-氨基苯并咪唑）对蚯蚓血细胞染色体畸变的诱导作用不明显，因此多菌灵的致癌致畸作用可能与这几种物质无关。

参考文献

[1] 张戈壁，阳廷密，王明召. 苯菌灵对香蕉灰纹病菌室内毒力测定[J]. 广西园艺，2004，15（2）：25-26.

[2] 宋远超，于功昌，王筱芬. 多菌灵生殖毒性研究进展[J]. 中国职业医学，2010，37（6）：505-507.

[3] 郎 漫，李 平，蔡祖聪. 多菌灵在土壤中的降解及其生态环境效应[J]. 农药，2012，51（1）：8-10.

[4] 花日茂，岳永德. 苯并咪唑类杀菌剂在环境中的降解代谢[J]. 安徽农学院学报，1991，18（1）：84-86.

[5] 蔡 兴，范宁云，孙 锦. 多菌灵在三种蔬菜中的降解研究[J]. 甘肃科技，2009，25（3）：62-63.

[6] 陈铭学，牟仁祥，吴 俐. 反相离子对高效液相色谱法测定蔬菜中多菌灵残留量[J]. 分析试验室，2005，24（11）：54-56.

[7] 任海军.百事“纯果乐”橙汁中发现极少量杀菌剂[EB/OL]. http：//news.xinhuanet.com/world/2012-01/15/c_111439597.htm， 2012-01-15/2014-09-26.

[8] 杭州网. 调查报告显示多款茶叶农药残留超标[EB/OL]. http：//news.hangzhou.com.cn/gnxw/content/2012-04/

12/content_4148249.htm， 2012-04-12/2014-09-26.

[9] 于功昌，王筱芬. 多菌灵的毒理学研究进展[J]. 职业与健康，2008，24（17）：1 834-1 835.

[10] 曹柳燕，陈关喜，冯建跃，等. 多菌灵原药中2 个酚嗪类杂质含量的高效液相色谱法测定[J]. 分析测试学报，2008，27 （4）：412-414.

[11] 刘 伟，朱鲁生，王 军，等. 毒死蜱、马拉硫磷和氰戊菊酯对赤子爱胜蚓（Eisenia foetida）的急性毒性[J]. 生态毒理学报，2009（4）：597-601.

[12] 陈志伟，李兴华. 铜镉单一及复合污染对蚯蚓血细胞微核的诱导[J]. 农业环境科学学报，2006，25（5）：1 193-1 197.

[13] 黎杰强，黄海琳，李丹霞，等. 3种常用农药对蚕豆根尖细胞的遗传毒性[J]. 华南师范大学学报，2008（1）：112-117.

[14] 吴丽明，黄伯俊. 多菌灵对雄性小鼠生殖细胞染色体畸变的影响[J]. 卫生毒理学杂志，1993，7（1）：52-53.