槟榔乙醇提取物对猪鸡五种致病菌的抑菌作用初探

周璐丽 王定发 周汉林 侯冠彧 李韦

摘 要 采用倍比稀释法，评价了槟榔青果的乙醇提取物对猪鸡养殖中常见致病菌的抗菌作用。结果表明：提取物对鸡大肠杆菌、鸡沙门氏菌、鸡金黄色葡萄球菌、猪大肠埃希菌、猪金黄色葡萄球菌等5种致病菌有一定的抑菌作用，最低抑菌浓度（MIC）分别为62.5、31.25、31.25、62.5、62.5 g/L，而最低杀菌浓度（MBC）分别为125、62.5、62.5、125、125 g/L。

关键词 槟榔提取物 ；大肠杆菌 ；沙门氏菌 ；金黄色葡萄球菌 ；最低抑菌浓度 ；最低杀菌浓度

分类号 S852.61 ；R285.5

槟榔属于棕榈科植物，为中国五大南药之首，主要产于我国海南、广东、广西、云南、福建和台湾等地。槟榔主要含有生物碱、鞣质、油脂等化学成分[1]，具有杀虫消积、降气等功效，是常用的驱虫、消积药物，对于肠道寄生虫、痢疾腹泻、脚气肿胀等具有较好的疗效[2]。目前相关研究大多集中于槟榔提取物的驱虫作用[3-5]、抗氧化[6-8]、促进胃肠道蠕动[9]等方面。

肠毒性大肠杆菌、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌是较常见的引起人类和畜禽细菌性肠道疾病的致病菌，严重危害人类和动物的安全。随着我国畜禽养殖的发展，畜禽肠道致病菌多重感染、抗生素长期大量使用带来的畜产品安全问题日益突出，因此急需开发抗菌活性高、低毒性、低残留、广谱的饲料添加剂以提高畜禽肠道细菌多重感染性疾病的控制水平。目前对槟榔抗细菌，特别是常见的肠道致病菌方面研究较少。本研究针对猪鸡生产中常见的几种致病菌（猪、鸡大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鸡沙门氏菌），探讨槟榔乙醇提取物的体外抑菌效果，为开发以槟榔提取物为主的饲料添加剂应用于猪鸡养殖提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

槟榔（Areca catechu）青果采自儋州市中国热带农业科学院热带植物园。氢溴酸槟榔碱标准品购自中国食品药品检定研究院。鸡大肠杆菌（CVCC249）、鸡沙门氏菌（CVCC533）、鸡金黄色葡萄球菌（CVCC1885）、猪大肠埃希菌（CVCC224）、猪金黄色葡萄球菌（CVCC546）标准菌株，均购自中国兽医药品监察所。营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、麦康凯培养基、Baird-Parker琼脂基础培养基、SS琼脂培养基均购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 槟榔提取物制备

将槟榔青果切开，65℃烘干，粉碎。称取50 g烘干粉碎样，加入700 mL 85%乙醇，85℃，热回流提取2 h，减压抽滤，得滤液后，旋转蒸发得浸膏，用丙酮定容至50 mL，即得1000 g/L溶液（按原料算），用一次性滤菌器过滤除菌。

1.2.2 菌悬液制备

将5种菌株分别接种到2 mL灭菌营养肉汤试管中进行纯培养。取0.5 mL纯培养后菌悬液，加入到4.5 mL的灭菌营养肉汤中，依次进行10倍倍比稀释，采用10-5、10-6、10-7和10-8浓度涂板，每个浓度3个平行，选取菌落数在30～300之间进行计数。算得菌悬液浓度后，将其配制成10×105 CFU/mL试验菌液。

1.2.3 槟榔提取物中槟榔碱含量测定

参照刘文杰（2012）[10]方法，采用比色法测定槟榔提取物中槟榔碱的含量。

1.2.4 最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）测定

采用试管倍比稀释法，取24支试管，分为3组，每组8支。用移液枪吸取1 mL灭菌营养肉汤于每支试管，再于每组第1支试管加入1 mL槟榔提取物溶液（1000 g/L），摇匀，然后再从每组第1管吸取1 mL混合溶液加入第2支试管，混匀后，再从第2支试管吸取1 mL混合溶液加入第3支试管，依次类推一直到第6管，再从第6管吸取1 mL混匀液去掉。第7管为阳性对照，第8管为阴性对照。将1 mL 10×105 CFU/mL试验菌液分别加入到上述各管中，阴性对照加入1 mL灭菌营养肉汤。混匀后，将上述试管放入37℃培养箱中培养24 h。

按照文献[11]判定最低抑菌浓度（MIC）：首先观察细菌阳性对照组长菌呈浑浊状态，而阴性对照组不长菌呈透明清亮状的前提下，观察各浓度组的浑浊情况，以判断不同浓度槟榔提取物的抑菌作用。如试管内呈严重浑浊，表明有细菌生长，用“++”表示；如轻微浑浊，用“+”表示；如试管内透明清亮，表明无细菌生长，用“-”表示。

1.2.5 最低杀菌浓度（minimal bacteriocidal concentration，MBC）测定

吸取上述澄清透明的的各试管培养物0.2 mL，将含有鸡和猪大肠杆菌的培养物接种到麦康凯培养基培养板上；含有鸡沙门氏菌的试管培养物接种到SS琼脂培养基上，含有金黄色葡萄球菌试管培养物接种到Baird-Parker琼脂基础培养基上，每个试管接种到3个培养基作为重复，编号，37℃培养24 h，观察有无细菌生长，以培养板上计数少于5个菌落作为对应的试管内药物浓度为该菌株的最低杀菌浓度（MBC）。

2 结果与分析

2.1 槟榔提取物中槟榔碱含量

测得槟榔干粉中槟榔碱含量为0.37%，提取物溶液1000 g/L溶液（按原料算）中槟榔碱浓度为3.7 g/L。

2.2 槟榔提取物对几种致病菌的抑菌效果

不同浓度槟榔提取物对几种畜禽致病菌株的抑菌效果见表1。结果表明，槟榔提取物对鸡沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的MIC 为31.25 g/L，对鸡大肠杆菌、猪大肠埃希菌、猪金黄色葡萄球菌的MIC为62.5 g/L。

槟榔提取物对几种畜禽致病菌株的最低杀菌浓度见表2。结果表明，槟榔提取物鸡沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的MBC 62.5 g/L，对鸡大肠杆菌、猪大肠埃希菌、猪金黄色葡萄球菌的MBC 125 g/L。

3 讨论与结论

由于产地和品种的不同，槟榔中槟榔碱含量略有差异，一般槟榔中槟榔碱含量为0.3%～0.6%[12]，在本次试验中通过分光光度法测得槟榔中槟榔碱含量为0.37%。

黄玉林等研究了采用索式提取法提取的槟榔提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、米曲霉、黄曲霉6种菌的体外抗菌作用。结果表明，槟榔提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有较好的抗菌作用，对酿酒酵母、米曲霉、黄曲霉没有抗菌作用[13]。刘文杰等采用双层平板打孔法研究了槟榔壳乙醇提取物对食品中几种常见的的细菌和真菌的抑制作用。结果表明，槟榔壳乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌的MIC分别为8.75、4.375、35和35 g/L，而对真菌酿酒酵母、黑曲霉、根霉没有抑制作用[10]，其对大肠杆菌的MIC与本试验中对鸡大肠杆菌的MIC较为接近。本试验中，槟榔提取物鸡沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及猪大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的MIC分别为62.5、31.25、31.25、62.5和62.5 g/L，表明槟榔提取物对鸡大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有较好的抑制作用。对鸡和猪金黄色葡萄球菌的MIC的差异，可能由于金黄色葡萄球菌菌株的宿主不同而导致的耐药性差异导致。

大肠杆菌、沙门氏菌、大肠埃希菌等致病菌感染动物后主要造成消化道疾病，如新生幼畜腹泻、痢疾等。而致病性金黄色葡萄球菌感染动物后会引起局部化脓感染以及败血症等。众所周知，抗生素添加剂在畜牧业生产中长期、大量使用造成药物残留，已严重影响到畜产品的质量，另外抗生素的滥用导致严重多重耐药与交叉耐药。植物提取物本身具有低毒、低残留、低耐药性，是抗生素所不具备的。而且植物提取物往往并不仅体现在抑菌方面，更重要的是植物提取物中含有的多种活性成分能够调动动物机体的免疫力，达到抵抗病原微生物的目的。因此，开发植物饲料添加剂具有重要的意义。本次研究表明，槟榔乙醇提取物对五种猪鸡主要致病菌具有一定的抑制作用，且对鸡大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有较好的抑制作用，其MIC为31.25 g/L，但对一些耐药菌株及不同提取成分的抑菌机理还有待进一步研究。

参考文献

[1] 何细新，李亚军，胡小鹏，等. 槟榔壳中三萜及蒽醌类成分的分离及鉴定[J]. 中药新药与临床药理，2010，6（21）：634-636.

[2] 张春江，吕飞杰，陶海腾. 槟榔活性成分及其功能作用的研究进展[J]. 中国食物与营养，2008（6）：50-53.

[3] 赵文爱，李泽民，王伯霞. 槟榔与白胡椒对猪囊尾蚴形态学改变的影响[J]. 现代中西医结合杂志，2003（3）：237-238.

[4] 杨家芬，欧阳颗. 清热解毒中药对3种肠道寄生原虫的体外抑制作用[J]. 中国抗感染化疗杂志，2001（1）：43-49.

[5] 查传龙，陈光裕，吴美娟. 槟榔厚朴等对肝吸虫作用的

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