巴西橡胶树磷饥饿调控基因HbPHR1克隆与生物信息学分析

高乐 覃怀德 何鹏 曾日中

摘 要 天然橡胶主要来源于巴西橡胶树。海南植胶土壤磷素缺乏，而缺磷会导致橡胶树生长缓慢、干胶产量降低。本文通过RT-PCR技术从橡胶树中克隆了一个磷饥饿信号关键调控基因HbPHR1，基因全长1 560 bp，包含一个1 476 bp的完整读码框（ORF），编码491个氨基酸，分子量约为53.48 kD。HbPHR1具有MYB结构域和CC结构域，属于MYB-CC家族成员，为酸性不稳定蛋白，具有较强的亲水性。进化树分析表明，HbPHR1与拟南芥AtPHR1、油菜BnPHR1归为一个亚类。HbPHR1的克隆对解析橡胶树磷信号转导机制、创制磷营养高效利用橡胶树材料具有重要意义。

关键词 橡胶树 ；磷饥饿 ；HbPHR1 ；生物信息学

分类号 S794.1

天然橡胶是重要的工业原料和国防战略物资，主要来源于热带树种——巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）。中国是橡胶消费大国，国内橡胶市场缺口巨大。磷对橡胶树生长发育、产排胶具有重要的作用。供磷不足，会致使橡胶幼树叶片数量明显减少，根系生长不发达，干围增长十分缓慢；对于已开割橡胶树，会导致乳胶机械稳定性下降，出现早凝减产，及胶乳干胶产量降低[1]。海南植胶土壤大部分pH值约4.7，属于典型的酸性土壤，磷肥利用有效性低，低于我国平均利用率15%～25%[2]。以土壤全磷含量低于0.8～1.0 g/kg、速效磷含量50～80 mg/kg的标准来衡量海南胶园土壤磷素供应水平，目前胶园土壤磷素供应水平仍然处于较差状态[3]。因此提高橡胶树磷营养的利用效率对提高橡胶树的产量具有重要作用。前人研究表明，AtPHR1在拟南芥磷信号系统中起关键作用。AtPHR1具有MYB结构域（MYB domain）和卷曲螺旋结构域[coiled-coil （CC） domain]，属于MYB-CC转录因子家族成员。AtPHR1功能缺失会导致磷饥饿诱导基因（AtIPS1、AtRNS1和 At4）表达水平下降，叶片累积花青素[4]。AtPHR1以二聚体形式结合到不完全回文序列（GNATATNC）顺式作用元件[5]。已有研究表明，许多磷饥饿诱导基因具有该顺式作用元件，表明AtPHR1是磷饥饿信号途径的关键调控因子[6]。目前，关于巴西橡胶树磷信号途径的研究较少，本文以拟南芥AtPHR1搜索橡胶树转录组数据库[7]，克隆了橡胶树磷饥饿信号调控基因HbPHR1，并进行了生物信息学分析。该基因的克隆对橡胶树磷信号转导途径研究及磷养分高效利用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为橡胶树主裁品种‘热研7-33-97，通过Hoagland营养液进行磷饥饿胁迫水培处理。磷饥饿胁迫处理水培液磷素的浓度为0 mg/L，收集低磷胁迫处理1 d的根部组织材料，液氮速冻后，-70℃保存。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成

橡胶树根部组织RNA提取采用Tang等方法提取[8-9]，提取RNA后用DNaseⅠ去除残留的微量DNA。采用反转录试剂盒（Fementas）进行反转录合成cDNA。

1.2.2 HbPHR1基因全长的克隆

根据EST拼接的序列设计基因特异性引物：5′端引物：5′-ATGGAGGCACGCCCTGC-3′，3′端引物5′-TTAGGCATCTGTTCTCG-3′。PCR反应的总体系为20 μL，包括1 μL模板、引物各0.4 μL、含MgCl2的缓冲液10 μL、2.5 mmol/L dNTPs Mix 3 μL、1 U的LA Taq DNA聚合酶0.4 μL。PCR扩增程序为95℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，35个循环；72℃ 5 min。1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，TaKaRa凝胶回收试剂盒回收纯化目的片段，连接在pMD18-T载体上并转化大肠杆菌DH 5α，挑取正确的克隆送往广州英俊生物有限公司测序。

1.2.3 HbPHR1基因生物信息学分析

通过NCBI Blastp软件进行保守结构域分析，利用在线分析工具ProtParam分析蛋白的理化性质，ProtScale在线分析蛋白的亲水性，Tmpred在线分析蛋白跨膜结构域。在 NCBI 网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载具有MYB-CC结构域的植物蛋白序列，利用ClustalX1.83 和 MEGA5.1软件进行基因进化树分析。

2 结果与分析

2.1 HbPHR1基因的克隆

通过HbPHR1基因特异引物扩增出一条1 500 bp左右的条带（图1），所扩增的目的条带与预测的条带大小一致。将扩增的 DNA 片段回收测序鉴定，确认该基因全长1 560 bp。

2.2 HbPHR1基因序列分析

HbPHR1基因包含一个1 476 bp的完整读码框，编码491个氨基酸，分子量约为53.48 kD。NCBI结构域分析表明，HbPHR1具有MYB（ MYB domain）结构域和CC[coiled-coil （CC） domain]结构域，属于MYB-CC家族成员，与已知植物PHR1存在较高的同源性（图2）。ProParam蛋白质的理化分析表明，该蛋白丝氨酸Ser含量最高，为15.7%，其次为谷氨酸Glu（8.4%），含量最低的为半胱氨酸Cys和色氨酸Trp，为1.0%；酸性氨基酸数量（Asp+Glu）为59，碱性氨基酸数量（Arg+Lys）为43，理论等电点pI为5.45，属于酸性蛋白；不稳定系数（Instability index）为63.47，属于不稳定蛋白。

2.3 HbPHR1蛋白的疏水性/亲水性分析

利用ProtScale预测HbPHR1蛋白氨基酸序列的疏水性/亲水性。依据氨基酸分值越低亲水性越强，分值越高疏水性越强的规律，可以看出，多肽链第29位具有最高的分值1.489和最强的疏水性；第458位具有最低的分值-3.122和最强的亲水性。橡胶树HbPHR1的整条多肽链表现为较强的亲水性。

2.4 HbPHR1蛋白的跨膜结构分析

根据TMPred分析，只有超过500分的才被认为显著。HbPHR1蛋白氨基酸序列分值均低于500分的显著值，故可推测HbPHR1未含有跨膜结构域。

2.5 HbPHR1进化树分析

将HbPHR1与MYB-CC家族中的拟南芥、水稻、小麦、衣藻、油菜、菜豆成员进行系统进化树分析（图4）。分析结果表明，巴西橡胶树HbPHR1与拟南芥AtPHR1、油菜BnPHR1归为一个亚类，与水稻[Os-PHR1（NP_0010

50006）、Os-PHR2（AK100065）]，小麦[Ta-PHR1-A1（KC218925）、Ta-PHR1-B1（KC286910）、Ta-PHR1-D1（KC286911）]相距较远。

3 讨论与结论

PHR蛋白为植物磷信号转导关键调控蛋白，对植物的生长发育起着重要作用。过表达AtPHR1提高了拟南芥茎中磷含量，同时提高了磷转运子、磷酸酶、RNA酶等磷饥饿诱导基因的表达水平[10]。同时AtPHR1还调控拟南芥根系的生长，AtPHR1功能缺失突变体根毛长度变短，而超表达PHR1可在缺磷条件下促进根毛的生长[11]。水稻中分离了2个与AtPHR1同源的基因OsPHR1和OsPHR2，过表达OsPHR2显著提高茎叶磷含量，甚至会导致磷中毒。过表达小麦Ta-PHR1-A1可以提高磷的吸收及小麦穗粒数，进而提高小麦产量。本研究在橡胶树中克隆了PHR基因，基因全长1 560 bp，包含一个1 476 bp的完整读码框，编码491个氨基酸，具有MYB结构域和CC结构域，属于MYB-CC家族成员。不同品系的橡胶树在磷利用率上存在基因型的差异[12]。HbPHR1基因的克隆为解析橡胶树磷信号转导机制提供了研究基础，为创制磷营养高效利用橡胶树材料提拱了基因资源，对提高橡胶树磷素利用效率，节约磷矿资源，减少环境污染，促进橡胶树增产具有重要意义。

参考文献

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