EV71病毒引起手足口病患儿免疫状态变化的研究

柯江维，陈强，段荣，朱庆雄，刘洪，邹峥

(江西省儿童医院，江西 南昌 330006)

Enterovirus 71(EV71)属细小RNA病毒科肠道病毒属病毒，是手足口病 (hand,foot and mouth disease,HFMD)的主要病原体[1]。该病毒具有明显嗜皮肤和嗜神经特性，其临床表现轻重不一，轻者仅表现为自限性手足口病或疱疹性咽峡炎，重者表现为脑膜脑炎、脑脊髓炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿等，甚至死亡。导致重症EV71感染的发病机制仍未完全清楚，推测可能与病毒直接侵犯组织细胞(如脑组织)或病毒脓毒症所致异常免疫反应有关[1]。本文就EV71病毒引起的手足口病患儿细胞免疫、体液免疫和部分细胞因子的变化进行研究，以期发现这些免疫功能状态的变化与疾病严重程度的关系,现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2010年5月至2011年9月在江西省儿童医院住院的手足口病患儿(病例组)，经核酸检测EV71阳性患者220例,其中男127例、女93例；年龄4月～6岁，平均年龄(2.4±0.72)岁。临床诊断、分型及治疗均符合卫生部颁布的手足口病预防控制指南(2010版)的规范[2]。其中普通患儿(普通组)117例,重症患儿(重症组)103例(重型：60例，危重型43例)。所有病例均无其他慢性疾病史，入组前未经任何治疗，这些患儿均按照临床表现及病情发展予以分期；同时收集206例健康儿童为对照组，其中男119例,女87例,年龄5个月～7岁,平均年龄(2.5±0.67)岁。病例组和健康对照组年龄、性别、体重相似，无统计学差异。

1.2 临床特征 重症HFMD均有脑炎并发症，如单纯并发脑炎、并发脑炎和肺炎及上呼吸道感染等其他并发症。重型组主要是指有发热、皮疹、神经系统受累，主要表现为嗜睡、易惊、肢体抖动、阵发性抽搐等。危重型组主要是指表现为高热 (体温39.0℃以上)，持续2～7d；患儿病情较危重，出现频繁抽搐和严重意识障碍，同时伴有循环系统和呼吸系统受累表现。

1.3 方法 病例组和对照组尽可能在同一时段采集静脉血4ml，其中2ml置普通管离心，分别用化学发光分析仪(Immulite1000，德国西门子公司)检测白介素-13(IL-13)和干扰素-γ(IFN-γ)；特定蛋白分析仪 (BNP，德国西门子公司)检测免疫球蛋白(IgG、IgA和 IgM)；剩余2ml置于EDTA-K2抗凝管，立即用六色流式细胞仪 (FACSCanto，美国BD公司)检测T细胞亚群、B细胞和NK细胞的相对含量。以上所有试剂都配套，操作严格按试剂盒说明书进行。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析。计量资料以 表示,采用t检验；计数资料采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 手足口三型与健康对照组IgG、IgA、IgM、IL-13和IFN-γ的含量变化 手足口三型与健康对照组比较，五项指标都增高，除普通型的IgG、IgA没有统计学意义以外，其它都差异有统计学意义 (P＜0.01)；而手足口三型之间比较，随着病情的加重，五项指标的浓度也不断增高，差异都有统计学意义(P＜0.01)。 见表1。

表1 手足口三型与健康对照组IgG、IgA、IgM、IL-13和IFN-γ的含量(±s)

表1 手足口三型与健康对照组IgG、IgA、IgM、IL-13和IFN-γ的含量(±s)

注：与健康对照组比较，△P＜0.01；与普通型组比较，▲P＜0.01；与重型组比较，※P＜0.01。

组别 例数 IgG(g/L) IgA(g/L) IgM(g/L) IL-13(ng/L) IFN-γ(ng/L)普通型组重型组危重型组健康对照组117 60 43 206 7.83±1.25 10.86±2.15△▲15.14±3.10△▲※7.78±2.41 0.81±0.40 1.50±0.47△▲1.76±0.53△▲※0.76±0.37 1.37±0.32△1.74±0.21△▲2.05±0.46△▲※1.10±0.51 37.21±7.85△59.12±10.43△▲70.27±9.13△▲※26.43±6.76 37.21±7.85△59.12±10.43△▲70.27±9.13△▲※26.43±6.76

2.2 手足口三型与健康对照组T细胞亚群 (CD3+、CD4+、CD8+)、B 细胞(CD19+)和 NK(CD16+56+)细胞的相对含量变化 普通型组与健康对照组比较CD3+、CD4+、CD8+稍微增高，差异无统计学意义(P＞0.05)，CD16+56+、CD19+增高，差异有统计学意义(P＜0.01)；其它两型与健康对照组比较， CD3+、CD4+、CD8+、CD16+56+的含量都显著降低，而CD19+显著增高，差异都有统计学意义(P＜0.01)；CD4+/CD8+的比值无显著变化，差异无统计学意义(P＞0.05)。手足口三型之间比较， 随着病情的加重，CD3+、CD4+、CD8+、CD16+56+的含量的不断降低，而CD19+不断增高，差异都有统计学意义(P＜0.01)。见表2。

3 讨论

儿童是一类特殊的群体，其免疫系统功能的发育与成人相比尚不健全，这就成为病原微生物进攻机体的一个重要突破口。儿童，特别是婴幼儿，是处于生理性免疫低下的状态，固有免疫及适应性免疫功能均较成人差，这也可能是手足口病易感于5岁以下儿童的重要原因[3]。研究指出，淋巴细胞是机体免疫系统功能中最重要的一类细胞，是反映机体免疫状态的重要指标[4]。在免疫应答过程中，末梢血淋巴细胞发育分化成为功能不同的亚群，T、B、NK细胞。当亚群的数量和功能发生异常时，就能导致机体免疫紊乱并产生病理变化。尤其是T淋巴细胞以及T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+的数量和相对比值的变化在免疫系统中占主导地位[5]，CD4+与CD8+淋巴细胞两者相互诱导、相互制约形成T细胞网络，以调节机体的免疫功能和维持免疫的自稳性。当T细胞网络失衡时，造成抑制性T细胞(Ts)功能和分化异常，Ts有可能通过释放抑制因子抑制效应T细胞活化，从而造成机体免疫功能紊乱[6]。

表2 手足口三型与健康对照组 CD3+、CD4+、CD8+、CD19+和 CD16+56+的含量(±s，%)

表2 手足口三型与健康对照组 CD3+、CD4+、CD8+、CD19+和 CD16+56+的含量(±s，%)

注：与健康对照组比较，△P＜0.01；与普通型组比较，▲P＜0.01；与重型组比较，※P＜0.01。

组别 例数 CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ CD16+56+ CD19+普通型组重型组危重型组健康对照组117 60 43 206 64.48±4.82 48.53±8.12△▲41.58±7.11△▲※63.53±6.82 39.72±3.60 27.68±6.56△▲22.04±5.86△▲※38.78±4.81 27.30±4.08 20.59±3.70△▲15.59±3.16△▲※26.32±3.17 1.43±0.42 1.37±0.40 1.28±0.37 1.45±0.33 25.32±5.34△10.43±4.36△▲6.78±3.35△▲※20.21±10.34 22.12±9.30△30.15±11.34△▲40.23±12.57△▲※18.67±8.73

然而，在感染的早期一般是以固有免疫反应为主，表现在NK细胞百分比升高，当发展至危重症时，固有免疫的作用已不能使疾病恢复，受某些固有免疫分子的指引，启动不同类型的适应性免疫反应[7],主要原因是NK细胞是一类特殊性质的细胞群体，无需抗原的预先刺激与活化即可发挥细胞毒作用，并分泌多种细胞因子和趋化因子，如IFN、TNF、IL-13等。

从本实验HFMD普通组来看，首先是NK细胞和两个炎性分子升高，T细胞亚群变化不明显，B细胞也同时启动，说明是固有免疫在发挥抗EV71病毒的作用，但随着病情的加重，HFMD患儿T淋巴细胞及NK细胞均明显下降，B淋巴细胞明显增高，提示患儿机体的细胞免疫功能降低，不能有效抵御病毒感染，杀灭受感染的细胞，随即启动适应性免疫反应，可能导致病程延长，而病程的延长又使机体免疫功能进一步受损，发生极其复杂的免疫功能变化，轻症患儿处于全身炎性反应综合征，重症患者处于代偿性抗炎性反应或混合性拮抗反应状态。有证据表明这些都与EV71可通过凋亡CD3+、CD4+、CD8+细胞及 NK 细胞而抑制细胞免疫有关[8]。至于随着病情加重，HFMD患儿外周血B淋巴细胞明显增高，可能与机体增强抗病毒抗体中和病毒作用有关。在HFMD普通型患儿，由于病情较轻，同时有增高的NK细胞保护，机体适应性免疫(B细胞)只是辅助，故我们只检测到初次体液免疫反应时起主要作用的免疫球蛋白IgM增高。而随着病情加重，患儿进入到重症期时，T细胞、NK细胞比例不断下降，细胞免疫进一步受损，适应性免疫(B细胞)可能起更大作用，由此引发的抗体和炎性因子会大量增加。正如我们在实验中观察到的，HFMD重型和危重型患儿的 IgG、IgA、IgM、IL-13和IFN-γ异常增高，特别是危重型患儿，检测值更是远离健康对照组和普通型组，如有1例神经源性肺水肿的危重型患儿的IgG大于30g/L。实验结果提示：随着HFMD病情的加重，患儿血清免疫球蛋白水平会出现明显改变，表明在手足口病重症期，患儿体内出现免疫功能亢进，产生大量的免疫球蛋白来保护机体、促使病情的恢复，但同时又会对机体造成一定程度的免疫伤害，使患儿的病情进一步向危重症发展。这也是HFMD患儿在急性感染期体内的体液免疫及细胞免疫均被激活，但过度激活的体液免疫及激活不足的细胞免疫相争相抗的局面造成的。

至于细胞因子又是如何参与病情的发展过程？实验中只对两个代表性细胞因子IFN-γ、IL-13进行了检测，结果显示，HFMD三型患儿血清中细胞因子IFN-γ、IL-13均升高，并且随着病情加重而增加，提示介导机体炎性反应。许多研究者[9-11]指出，正常情况下体内细胞因子间相互制约，共同维护免疫平衡，且含量很低。EV71病毒侵入机体后，免疫细胞被激活分泌细胞因子，细胞因子一方面参与机体免疫防护，另一方面也参与机体免疫病理损伤。IFN-γ主要是由Th1细胞和单核巨噬细胞分泌的，介导细胞免疫反应，而细胞免疫在抗病毒反应中起着主要作用；IL-13主要由Th2细胞分泌，抑制Th1细胞和单核-巨噬细胞增殖和活化，促进B淋巴细胞增殖和活化，介导体液免疫反应。二者分别增高，相互拮抗，共同促进病情发展。

纵观全文，EV71感染所致HFMD患儿出现细胞免疫、体液免疫和先天性免疫功能紊乱，并与疾病的严重程度有关。提示HFMD患儿入院时应及时检测这三大免疫功能指标，并监测这些指标的变化。若患儿T淋巴细胞亚群、NK细胞含量逐渐降低，B淋巴细胞、免疫球蛋白含量及IFN-γ、IL-13明显增高或逐渐增高时，要引起重视，进行积极的干预，防止疾病可能向重症、危重症转变，甚至出现死亡。

[1]Wang SM，Lei HY，Huang KJ，et al．Pathogenesis of enterovirus 71 bminstem encephalitis in pediatric patients:roles of cytokine and cellular immune activation in patients with pulmonary edema[J]．J Infect Dis，2003，188(4):564-570．

[2]中华人民共和国卫生部.手足口病诊疗指南(2010年版)[EB/OL].[2012-04-16].http://www.moh.gov.cn/mohyzs/s3586/201004/46884.shtml.

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[7]周光炎.创新理论推动免疫学的发展:介绍和讨论一些正在流行和有创意的免疫学假说[J].中国免疫学杂志,2009,25(1):27-30.

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