肺鳞癌及腺癌中NGAL表达的免疫组化研究

王彩纹，刘翼军，熊国亮，余少良

(江西省胸科医院，江西 南昌330006)

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL) 是lipocalin家族的一个成员，在中幼粒细胞和晚幼粒细胞分化阶段合成，其功能尚不清楚[1]。以前的研究显示NGAL可能参与多样的生化过程，涉及胚胎发育、细胞分化、炎症免疫应答、细胞凋亡、脂质代谢、肿瘤的发生发展等等[2]。因其在人类多种肿瘤及炎症组织细胞中异常表达，且可能参与免疫炎症反应以及肿瘤的发生发展，近年来已成为肿瘤相关研究领域的一个新热点。本研究旨在通过免疫组化技术检测NGAL在肺鳞癌及腺癌组织中的表达，探讨NGAL在其临床和病理诊断中可能的作用及意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选择2009年3月至2011年3月在江西省胸科医院手术治疗并获得其目前转移等情况资料的肺鳞癌35例及腺癌30例(男42例；女23例)作为实验组，并取其中及相应42例(男28女14)癌旁肺组织(远离肿瘤组织至少5cm，另23例因取材原因舍弃)为对照组，年龄23～72岁，中位年龄47岁；所有患者术前均未进行放化疗及内分泌治疗，据2008年WHO肺癌分类标准进行组织学分类：鳞癌35例，腺癌30例，高分化5例，中分化51例，低分化6例。依据国际抗癌联盟2009年修订的肺癌TNM分期标准进行分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期26例，Ⅲ期23例；伴有淋巴结转移的患者31例，无淋巴结转移的患者34例。所有患者术前均未行化疗、放疗等辅助治疗。以上标本手术切取后立即置于液氮中保存备用，其余部分常规送病理检查。

1.2 试剂 鼠抗人NGAL单克隆抗体 (NGAL，sc－07，1∶200)， 购于美国圣克鲁斯生物技术公司，(货号sc-80234)，免疫组化SP法试剂盒及 DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 方法 68℃烤片20min后,常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；3%H2O237℃孵育10min，PBS冲洗3次(每次不少于5min)；抗原修复后以羊血清工作液封闭，37℃孵育10min加一抗于4℃ 冰箱过夜，用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照；滴加生物素标记二抗,37℃孵育30min,PBS冲洗后滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液；二氨基联苯胺(DAB)显色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。

1.4 结果判定 NGAL的表达以细胞浆有棕黄色着色为阳性，所有切片均由本院2位资深病理医师采用双盲法观察切片，每张切片随机选取4个高倍视野(×400)，各计数200个细胞。具体判断标准为无色0分，淡黄色1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；另根据染色程度及阳性染色细胞数占肿瘤细胞总数的百分比来综合计分，阴性为0分，阳性细胞率≤10%为1分，11%～50%为2分，＞50%为3分；将二者之乘积记为阳性标记指数(label index，LI)，以此判断表达强度，将LI分为四个等级，0～2 分视为阴性(-)，3～4 分为弱阳性(+)，5～6 分为中等阳性(++)，＞6 分为强阳性(+++)[3]。

1.5 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件，各组间率比较采用χ2检验，分析 NGAL蛋白间关系采用Spearman等级相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 在35例鳞癌、30例腺癌及相应42例癌旁组织中，NGAL蛋白的阳性表达均呈棕色颗粒分布，其中在肺腺癌及鳞癌组织中阳性表达则主要表达于细胞浆，局部、灶性和弥漫性表达均有，腺癌中弥漫性表达比鳞癌相对较多；远癌肺组织中阳性表达则主要表达于细胞膜内表面，极少细胞有弥散性表达(图1)。阳性对照可见明显胞浆阳性信号显示，阴性对照则无阳性信号显示。NGAL蛋白在30例肺腺癌中有14例呈强阳性表达 (46.7%)，11例呈阳性表达(36.7%)，5例呈阴性表达(16.7%)；在35例鳞癌中有8例呈强阳性表达(22.9%)，13例呈阳性表达 (37.1%)，14例NGAL蛋白呈弱阳性或阴性表达 (40.0%)(表1)；而对照的42例癌旁组织中，仅12例呈阳性表达(28.6%)，NGAL蛋白在肺腺癌组织中的阳性表达率显著高于鳞癌，其在肺鳞状细胞癌组织中的阳性表达率又显著高于其癌旁组织(P＜0.05)。

2.2 NGAL的表达在所查肺癌病例中，有淋巴结转移的阳性表达率 (83.9%)高于无淋巴结转移者(58.8%)，差异有统计学意义(P=0.004)。且NGAL的阳性表达率随着TNM分期的升高而升高，I期、II期、III期患者中分别为56.3%、69.2%、82.6%，差异有统计学意义(P=0.024)。其表达与患者性别、年龄、吸烟无关(P>0.05)(表1)。

图1 肺腺癌、鳞癌及癌旁正常组织中NGAL蛋白的表达(SPх400)

3 讨论

非小细胞肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，其中约有80%为腺癌及鳞癌，近年来其发病率在我国呈上升和年轻化趋势，其发生、发展和转移均涉及极其复杂的多基因调控异常过程[3]。因此，研究肺癌的病因、发病机制具有重要的临床意义。

Lipocalin家族均有着一个高度保守的由8条反向平行的折叠桶状三级结构，可与疏水性小分子结合，也可与某些细胞膜受体结合,NGAL作为Lipocalin家族的一员，在细胞内环境稳定或免疫调节中扮演重要角色，除中性粒细胞外，正常情况下，NGAL蛋白亦可在腔道表面组织细胞微量表达，如呼吸系统的肺泡间巨噬细胞、消化系统的胃壁细胞小肠部分潘氏细胞、肝胆管细胞、前列腺上皮细胞等。但在机体呈病理状态时，其表达程度明显上调，众多学者认为是因其在抗感染中发挥的重要作用而引起[4]，进一步研究证实，NGAL蛋白还可能作为一种新的癌基因，在许多肿瘤中表达上调[5]。

本研究通过检测NGAL蛋白在65例肺癌患者的癌组织及癌旁组织中的表达，探讨其在肺鳞癌及腺癌的发生发展过程中的作用，进一步证实了NGAL作为一种癌基因的可能性。并探讨其与肺癌患者组织类型、性别、年龄、吸烟情况、分化程度和淋巴结转移情况的关系，从而进一步探讨NGAL在肺癌中的作用。发现NGAL在肺腺癌组织比肺鳞癌组织中有较高阳性表达率，且二者的阳性表达率均远高于癌旁正常肺组织，说明NGAL有可能成为肺鳞癌及腺癌诊断和判断预后的标志物。有研究表明NGAL蛋白是一种新的铁离子转运载体，与其受体一起介导了一条功能不同于转铁蛋白的新的铁离子的传导通路[6]。未与铁离子结合的NGAL蛋白能够清除表达NGAL受体细胞中的铁离子，使细胞内的铁离子水平降低，而引起细胞凋亡。结合铁离子的NGAL蛋白不能诱导细胞凋亡[7]。当然这仅仅是推断，在肺癌中还没有相关的验证，我们可以以此为理论依据进行研究肺癌的发生机制。

表1 NGAL的表达水平与肺鳞状细胞癌临床病理特征的关系

[1]Dizin E,Hasler U,Nlandu-Khodo S.Albuminuria induces a proinflammatory and profibrotic response in cortical collecting ducts via the 24p3 receptor[J].Am J Physiol Renal Physiol，2013,305(7):1053-1063.

[2]蒋奶贵,许丽艳,郭明洲.肿瘤相关蛋白 NGAL的生物学特征[J]．胃肠病学和肝病学杂志,2010,19(4)：297-301.

[3]Correnti C,Richardson V,Sia AK,et al.Siderocalin/Lcn2/NGAL/24p3 does not drive apoptosis through gentisic acid mediated iron withdrawal in hematopoietic cell lines[J].PLoS One,2012,7(8):e43696.

[4]丘佳明.乳腺癌患者肿瘤细胞 NGAL水平免疫组织化学测定的临床意义[J].放射免疫学杂志,2012,25(5):546-548.

[5]王彩纹,王小中.NGAL基因克隆载体的构建与鉴定[J].实验与检验医学,2009,27(3):217-219.

[6]Miethke M,Skerra A.Neutrophil gelatinase-associated lipocalin expresses antimicrobial activity by interfering with L-norepinephrine-mediated bacterial iron acquisition[J].Antimicrob A-gents Chemother,2010,54(4):1580-1589.

[7]Bao G,Clifton M,Hoette TM,et al.Iron traffics in circulation bound to a siderocalin(Ngal)-catechol complex[J].Nat Chem Biol,2010,6(8):602-609.