枸杞多糖对体外培养视网膜神经节细胞的保护作用△

杜然然 毕宏生 郭俊国 王兴荣 郭大东 田庆梅

视神经病变是临床常见的眼科疾病，严重影响患者的健康和生活质量。视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGC)是视神经病理性损伤的主要靶细胞。RGC-5的凋亡常见于青光眼、糖尿病视网膜病变等视网膜和视神经疾病，因此对RGC-5的保护作用成为近年来视神经疾病治疗研究的新热点。枸杞多糖是枸杞的主要有效成分之一，RGC-5是永生化的大鼠RGC细胞株［1］，属于未分化幼稚细胞，近年来广泛用于RGC-5相关研究。本研究利用谷氨酸制作RGC-5凋亡模型，再用不同浓度的枸杞多糖作用于凋亡模型，通过四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法及AnnexinV-FITC法检测枸杞多糖对RGC-5凋亡的保护作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 DMEM高糖培养基(Gibco)、L-谷氨酸(Sigma)、特级胎牛血清(Hyclone)、Thy 1.1 单克隆抗体(Abcam)、MTT(Sigma)、AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡检测试剂盒(USA)、PV免疫组织化学试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。水套式二氧化碳培养箱(HF160W，香港力新生物医疗科技控股有限公司);超净工作台(SW-CJ-2FD，上海博讯实业有限公司);酶标仪(Bio-tek/ELX800，USA);流式细胞仪(Accuri C6，USA);荧光倒置显微镜(O-lympus IX71，Japan);高速冷冻台式离心机(Neofuge 15R，香港力新生物医疗科技控股有限公司)。

1.2 大鼠RGC-5细胞的培养与鉴定 复苏RGC-5常规培养于含有体积分数为10%胎牛血清、100 U·mL－1青霉素和100 U·mL－1链霉素的 DMEM 培养基中，置37℃、体积分数5%CO2饱和湿度培养箱中贴壁培养，隔日换液。在倒置显微镜下观察细胞生长情况，每3～4 d用2.5 g·L－1胰蛋白酶消化并按1∶2传代。采用细胞免疫化学实验，常规培养RGC-5细胞，制作细胞爬片，40 g·L－1多聚甲醛固定30 min;置含10 g·L－1Triton的 PBS中，并于37℃孵育20 min;滴加内源性过氧化酶阻断剂于37℃孵育20 min，PBS洗涤3次;滴加Thy 1.1单克隆抗体(1∶500)，用PBS代替一抗做阴性对照，于湿盒中4℃过夜;隔天取出湿盒复温30 min，PBS洗涤3次;滴加生物素标记的二抗，室温孵育10 min;DAB显色，显微镜下观察显色效果，苏木素复染。Thy 1.1阳性表达主要位于细胞浆，以胞浆呈棕黄色为阳性染色。

1.3 谷氨酸诱导RGC-5凋亡模型的建立 实验分为对照组(不加谷氨酸干预)与谷氨酸5个干预组(4.0 mmol·L－1、4.5 mmol·L－1、5.0 mmol·L－1、5.5 mmol·L－1、6.0 mmol·L－1)，分别于不同条件下培养24 h后，应用MTT法测定各组细胞存活率。各谷氨酸干预组细胞存活率分别为对照组的69.5% 、60.8% 、49.2% 、45.1% 、42.2% ，5.0 mmol·L－1谷氨酸组存活率约为对照组的50%，故本研究选用 5.0 mmol·L－1谷氨酸作用 24 h，建立 RGC-5 凋亡模型。

1.4 枸杞多糖对谷氨酸致RGC-5凋亡模型的影响

1.4.1 实验分组 对照组用5 mmol·L－1谷氨酸培养基作用24 h，枸杞多糖组用5 mmol·L－1谷氨酸培养基作用 24 h 后，继续用 10 mg·L－1、20 mg·L－1、40 mg·L－1枸杞多糖培养基分别作用24 h和48 h。

1.4.2 MTT法检测 取对数生长期的 RGC-5，调整浓度至每孔10×103个细胞接种至96孔板中，细胞贴壁后，按照1.4.1中的方法进行干预。枸杞多糖作用24 h及48 h，每孔加 MTT 20 μL，继续孵育4 h后小心吸弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，在酶标仪上490 nm波长下测定吸光度值(A值)，细胞存活率=各枸杞多糖组A值/对照组A值。

1.4.3 Annexin V-FITC凋亡检测 将RGC-5按每孔0.15×106个接种于6孔板中，按照1.4.1中的方法进行干预;24 h及48 h时收集贴壁细胞，用冷PBS洗涤一次;然后将细胞重悬于 400 μL 1×Binding Buffer中;再加入10 μL Annexin V-FITC 4℃避光孵育15 min;加入5 μL PI于4℃避光孵育5 min。用流式细胞仪观察不同浓度枸杞多糖对细胞凋亡的影响，每组收集10×103个细胞进行分析。

1.5 统计学分析 数据以均数±标准差表示，采用SPSS 17.0统计分析软件，行单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态学观察与免疫化学鉴定 大部分RGC-5细胞复苏24 h后贴壁生长(图1)，属于未分化的幼稚神经元，呈上皮样，有较短的突起，显微镜下观察呈单层生长。采用Thy 1.1抗体对RGC-5进行鉴定，细胞质被染成棕黄色颗粒状(图2)。

Figure 1 Morphology of RGC-5(×200)RGC-5的细胞形态学观察(×200)

2.2 MTT检测 枸杞多糖作用24 h，对照组存活率为 48.7% ，枸杞多糖组(10 mg·L－1、20 mg·L－1、40 mg·L－1)细胞存活率分别为 53.1%、59.6%、66.9%，对照组与各浓度枸杞多糖组差异均有统计学意义(均为 P ＜0.05)，40 mg·L－1枸杞多糖组与20 mg·L－1枸杞多糖组之间差异有统计学意义(P＜0.05);枸杞多糖作用48 h时，各浓度枸杞多糖组细胞存活率分别为 60.5%、75.2%、88.6%，各浓度枸杞多糖组的RGC-5存活率明显高于对照组，对照组与各浓度枸杞多糖组差异均有统计学意义(均为P＜0.05)，且 40 mg·L－1枸杞多糖组 RGC-5 存活率最高，与20 mg·L－1枸杞多糖组之间差异有统计学意义(P ＜0.05)。

2.3 Annexin V-FITC凋亡检测 枸杞多糖作用24 h时，对照组凋亡细胞所占比例为44%，枸杞多糖组(10 mg·L－1、20 mg·L－1、40 mg·L－1)凋亡细胞比例分别为 20.6% 、12.3% 、8.5% ，对照组与各浓度枸杞多糖组凋亡细胞所占比例差异均有统计学意义(均为P＜0.05)，枸杞多糖作用48 h时，枸杞多糖组(10 mg·L－1、20 mg·L－1、40 mg·L－1)凋亡细胞比例分别为11.6%、6.2%、3.7%。枸杞多糖作用 24及48 h时，对照组与各浓度枸杞多糖组凋亡细胞所占比例差异均有统计学意义(均为 P＜0.05)，40 mg·L－1枸杞多糖组与 20 mg·L－1枸杞多糖组之间凋亡细胞所占比例差异均有统计学意义(均为P＜0.05)。说明枸杞多糖能在一定程度上减少 RGC-5凋亡率，且40 mg·L－1枸杞多糖作用48 h抗凋亡作用最好(图3)。

Figure 2 Immunohistochemistry staining of Thy 1.1 in RGC-5(×200)RGC-5 Thy 1.1免疫组织化学染色(×200)

Figure 3 Effects of LBP with different concentration on RGC－5 apoptosis detected by flow cytometry.A:Cultured with 10 mg·L－1 LBP for 24 hours;B:Cultured with 20 mg·L －1 LBP for 24 hours;C:Cultured with 40 mg·L －1 LBP for 24 hours;D:Cultured with 10 mg·L －1 LBP for 48 hours;E:Cultured with 20 mg·L－1 LBP for 48 hours;F:Cultured with 40 mg·L－1 LBP for 48 hours 流式细胞仪检测不同浓度枸杞多糖对RGC-5细胞凋亡的影响。A:10 mg·L－1枸杞多糖作用24 h组;B:20 mg·L－1枸杞多糖作用24 h组;C:40 mg·L－1枸杞多糖作用24 h组;D:10 mg·L－1枸杞多糖作用48 h组;E:20 mg·L－1枸杞多糖作用48 h组;F:40 mg·L－1枸杞多糖作用48 h组

3 讨论

枸杞是一种传统的中药，有“滋补肝肾，益精明目，平衡阴阳”等效用［2］。枸杞多糖是枸杞生物学作用的主要有效成分之一，是枸杞子萃取酒精的过程中去除脂溶性物质(如玉米黄质素和其他类胡萝卜素)而得到的含有多种微量元素和氨基酸的蛋白杂多糖［3］。研究发现，枸杞多糖具有多种药理作用和生物活性，在抗凋亡、抗氧化［4］、加强免疫作用［5］、降低血糖［6］、延缓衰老［7］、促进肿瘤细胞凋亡、保护肝脏［8］、降低化疗与放疗的副作用［9］和减轻胰岛素抵抗［10］中能发挥重要作用。

RGC-5的进行性死亡是青光眼、糖尿病视网膜病变、视神经炎、视神经萎缩、慢性缺血性视神经病变以及视网膜色素变性等许多视网膜和视神经疾病发展的必经之路。谷氨酸是正常存在于视网膜中的一种神经递质，但是当向活体玻璃体内注射谷氨酸或者用谷氨酸对体外培养的RGC进行干预时，有可能因量过多引起兴奋性毒性作用，导致 RGC的凋亡。

Thy1.1作为一种经典的 RGC-5特异性标记物，目前已被广泛用于RGC-5的标记鉴定与分离纯化。

我们对培养的细胞进行Thy1.1免疫组织化学染色，发现所培养细胞的细胞质被染成了棕黄色颗粒状，从而证明本课题中使用的细胞为RGC-5细胞系。MTT检测结果显示，常规培养的RGC-5在被谷氨酸作用后发生了凋亡，5 mmol·L－1谷氨酸作用24 h可造成约50%的RGC-5凋亡，并且不同浓度的枸杞多糖对发生凋亡的细胞进行干预后，细胞存活率在一定程度上有了提高，并且浓度为40 mg·L－1的枸杞多糖作用48 h后细胞存活率最高，呈现剂量-时间依赖性。Annexin V-FITC检测结果显示，不同浓度的枸杞多糖对发生凋亡的细胞进行干预后，细胞凋亡率一定程度上有下降，并且浓度为40 mg·L－1的枸杞多糖作用48 h后细胞凋亡率最低，呈现剂量-时间依赖性。Mi等［11］研究发现，枸杞多糖能够通过下调内皮素-1、高级糖基化终产物及其受体、β-淀粉样蛋白的表达来减轻青光眼模型中的视神经损伤;Li等［12］研究发现，视网膜缺血再灌注损伤模型中，枸杞多糖通过下调水通道蛋白、保护血-视网膜屏障和减少氧化应激起到保护作用。本课题组将继续深入研究枸杞多糖对RGC-5的保护机制。

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