不同日龄家兔对2种兔球虫易感性的对比研究*

王 丹 李 超 焦雅清 汪运舟 陶鸽如 顾小龙, 方素芳 崔 平 刘贤勇** 索 勋

(1.中国农业大学动物医学院，北京 100193; 2.河北北方学院动物科技学院， 河北张家口 075000)

兔球虫病是由艾美耳属球虫引起的、严重危害养兔业发展的寄生虫病(Pakandl, 2009)。兔球虫感染引发球虫病的同时还会继发感染产气荚膜梭菌、大肠杆菌、巴氏杆菌等，引起混合感染(Jingetal., 2012)。河北(崔平等，2010)、江苏(宋鸿雁等，2012)、浙江(简永利等，2014)等地区兔球虫感染情况的调查结果显示，家兔球虫感染率均在60%以上，甚至高达100%。其中以穿孔艾美耳球虫Eimeriaperforans、中型艾美耳球虫E.media、大型艾美耳球虫E.magna、无残艾美耳球虫E.irresidua、肠艾美耳球虫E.intestinalis和盲肠艾美耳球虫E.coecicola为主要感染虫种(Jingetal., 2012)。

普遍认为断奶至3月龄仔兔感染兔球虫最为严重(Sherkovetal., 1986)，但是此日龄范围内的家兔对球虫易感性差异尚未有报道，对其进行深入研究对于更加合理地进行药物防治和研究宿主抗球虫免疫有着十分重要的意义。

新西兰白兔是我国常见的肉用商品兔，具有繁殖力强、生长快、周期短等优势，70日龄时即开始出栏。因此，本研究根据新西兰白兔生长周期，选择30、50和70日龄幼兔，研究其对中型艾美耳球虫和无残艾美耳球虫的易感性，据此判断球虫对不同日龄兔的危害程度，进而为今后不同生长阶段的新西兰白兔的球虫病防控提供基础研究数据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与虫株

新西兰白兔购自北京兴隆实验动物养殖厂，饲养于无球虫环境中，1笼2只，饲喂经80℃烘烤2 h的饲料和饮水，粪检无球虫感染者用于本次实验。

选择中度致病、潜隐期较长的无残艾美耳球虫E.irresidua(Nortonetal., 1979)和潜隐期较短的中型艾美耳球虫E.media(Licoisetal., 1994)作为实验用虫种。实验用虫种源自2010年对河北地区兔球虫种类及感染率进行调查时分离并保存的中型艾美耳球虫和无残艾美耳球虫(崔平等，2010)。分别将5 000个孢子化卵囊接种于无球虫兔，收集显现期粪便中的卵囊，经28℃孵育至孢子化，获得中型艾美耳球虫和无残艾美耳球虫卵囊。

1.2 实验方法

选取30、50和70日龄的无球虫新西兰白兔各12只，共36只。用5 000个孢子化的中型艾美耳球虫和无残艾美耳球虫卵囊分别接种不同日龄的兔各6只。在接种后第4～9 d(接种中型艾美耳球虫组)和接种后第8～14 d(接种无残艾美耳球虫组)内，观察各组实验兔精神状态、采食饮水、排便等情况是否正常。在显现期内每日收集每个日龄组的粪便，用于卵囊排出量统计。

将每份粪样充分破碎混匀后从中抓取3份，每份2 g，置于小烧杯中，倒入60 mL饱和食盐水，吸取充分搅拌的混悬液充入改良麦克马氏计数板中，静置3～5 min后，置于显微镜下观察计数。所计卵囊数量乘以200即该样品的每克粪便卵囊量(Oocysts per gram, OPG)。排卵囊总量=OPG ×粪重。

1.3 数据处理

本实验利用SPSS13.0统计软件对各组OPG和卵囊排出总量进行统计，对组间差异性进行单因素ANOVA分析，图片用Graphpad Prism5.0软件制作。

2 结果

2.1 临床症状

30日龄的幼兔接种后均出现了精神沉郁、饮食减少和腹泻等症状；50日龄接种两种球虫的幼兔则分别有3和2只出现便秘的症状，但并无腹泻症状的出现；70日龄感染组则仅有1只接种中型艾美耳球虫的个体出现轻微的症状(表1)。

表1 各组实验兔显现期临床症状Tab. 1 Clinical sign of rabbits during patent period

图1 不同日龄家兔接种中型艾美耳球虫后显现期内OPG及排卵囊总量Fig. 1 OPG and total oocyst output of rabbits inoculated with Eimeria media during patent periodA：每克粪便卵囊量；B：排卵囊总量；*：P<0.05。图2同。A：Oocyst per gram (OPG)；B：Total oocyst output; *: P<0.05. The same with Fig.2.

2.2 中型艾美耳球虫卵囊排出情况

结果显示不同日龄的幼兔对中型艾美耳球虫的易感性有着较大差异。在卵囊显现期，各个日龄幼兔粪便OPG检测值差异极为显著(图1-A)，30日龄的幼兔卵囊排出水平远高于其他两组(图1-B)。从卵囊显现期的第2 d开始，每日卵囊排出量随着日龄增加而下降。粪便OPG和每日卵囊排出量的检测值表明新西兰白兔对于中型艾美耳球虫的易感性随着日龄的变化有着较大差异。

2.3 无残艾美耳球虫卵囊排出情况

本次实验中，感染无残艾美耳球虫的30、50、70日龄家兔的粪便总卵囊排出量分别为1.2×107、2.7×107和1.6×107(图2-B)。从造成临床症状的严重程度来看，虽然50日龄兔卵囊排出量最高，但30日龄兔症状最为严重(表1)。30日龄兔感染无残艾美耳球虫球虫后，其显现期的饮水饲料消耗均少于其他两组，有便秘、腹泻交替现象，粪便量极少。这些数据显示30日龄断奶前后的仔兔对无残艾美耳球虫更易感。

图2 不同日龄家兔接种无残艾美耳球虫后显现期OPG及排卵囊总量Fig. 2 OPG and total oocyst output of rabbits inoculated with Eimeria irresidua during patent period

3 讨论

本研究对30、50、70日龄家兔分别接种相同剂量的中型艾美耳球虫和无残艾美耳球虫，通过对粪便OPG和卵囊排出总量的统计以及临床症状的观察发现，30日龄的仔兔对球虫更易感。

研究表明未断奶仔兔对球虫不易感(Coudertetal., 1991; Pakandletal., 2007)，可能原因是母乳在抵抗球虫感染时起到重要的作用(Rose, 1973)。当未断奶仔兔开始吃料，其肠道菌群发生改变，随日龄增加，未断奶仔兔对球虫易感性增强，排卵囊量增加(Pakandletal., 2007)。另一方面，更大日龄家兔对球虫的易感性降低，可能原因是免疫系统的日趋完善，肠道菌群稳定。针对家兔肠道免疫系统的研究显示，家兔出生后6周隐窝生发中心出现B细胞，直至9周龄时，隐窝处才出现T细胞(Mage, 1998)。

目前，兔球虫病的防控仍然以药物防治为主，但长期用药造成药物残留给食品安全带来风险。参考本研究结果，有针对性地对断奶前后的仔兔进行药物防治，高日龄兔加强饲养管理，可减轻药物残留的危害，避免兔球虫感染带来较大的经济损失。

本研究仅对新西兰白兔的幼兔进行了2种兔球虫易感性研究，并未涉及其他毛兔或者獭兔，鉴于各类商品兔在其生长周期和个体发育上的差异，有必要对其他种类的兔进行研究，比较宿主之间易感性差异，为抗球虫免疫的探索提供研究基础。