鸡感染巨型艾美耳球虫后的体液、粘膜与细胞免疫应答*

任 超 赵世云 刘贤勇**

(1. 中国农业大学动物医学院, 北京 100193; 2. 天津农学院动物科学与动物医学学院, 天津 300384)

鸡球虫病是规模化养鸡场最为常见的疫病之一，其流行率高、对鸡生产性能危害大，每年给世界养禽业造成巨大经济损失(Blakeetal., 2014)。鸡的7 种球虫中，巨型艾美耳球虫Eimeriamaxima寄生于小肠中段，具有强致病性 (Long, 1959; Johnsonetal., 1970)。而更让人感兴趣的是，免疫原性强是巨型艾美耳球虫最显著的特征之一——鸡只免疫5个巨型艾美耳球虫卵囊即可获得针对同源虫种的完全免疫保护 (Leeetal., 1978; Blakeetal., 2012)。因此巨型艾美耳球虫可作为研究家禽与病原互相作用及禽免疫学的理想虫种。

血清中IgY含量的检测可用于评价球虫感染激发宿主产生的体液免疫应答，而胆汁和空肠组织中sIgA含量的检测则可反映球虫感染激发宿主产生粘膜免疫应答水平。细胞免疫反应在机体抵抗胞内寄生虫感染中起到十分重要的作用。激活的CD8+T细胞产生的IFN-γ可以阻滞球虫的再感染，且外源IFN-γ可以阻滞球虫在细胞内的发育，降低鸡只排卵囊量 (Lillehojetal., 1998; Bourgeoisetal., 2002)。因此通过检测分泌IFN-γ的脾脏淋巴细胞水平可以评价球虫感染所激发的细胞免疫反应情况。在本研究中，我们利用巨型艾美耳球虫进行3次间隔感染鸡只，通过酶联免疫斑点法等手段检测抗体应答和细胞免疫应答水平，从而反映其激发宿主产生的免疫应答特征及免疫保护力，为巨型艾美耳球虫的免疫原性解析提供更多的数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：28日龄白来航SPF鸡购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，饲养于禽用高效隔离器中，给以无球虫的水和饲料，鸡只自由采食。

1.1.2 虫株：本实验中使用的巨型艾美耳球虫北京株由中国农业大学国家动物寄生原虫实验室保存。

1.1.3 主要试剂与试剂盒：HRP-Goat anti-Chicken IgY-Fab、HRP-Goat anti-Chicken IgA购自BETHYL公司；Hyclone RPMI1640培养基和胎牛血清购自Thermo-Fisher公司；LymphospotTM无血清培养基和All-IN-ONE Mouse ELISPOT Accessory Kit购自北京达科为生物技术有限公司；Chicken IFN-γ 试剂盒购自Invitrogen公司；PVDF板购自Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 巨型艾美耳球虫感染：实验组与对照组各取25只鸡，在30、42和52日龄进行巨型艾美耳球虫孢子化卵囊口服，感染剂量分别为5×102、5×103、5×104个/只，对照组为无球虫感染的鸡只。

1.2.2 ELISA检测血清中的总IgY、胆汁和肠道中sIgA的滴度：根据免疫程序，在35、41、47、57日龄每组分别取5只鸡进行血清IgY、胆汁和肠道分泌型IgA水平的检测。采集静脉血分离血清；收集胆汁，1 mL/只；取鸡的空肠，纵向切开，剪成1 cm的小段，放入肠间IgA提取液中，4 ℃摇床消化4 h，4 ℃离心2 000 g，30 min，收集上清，加入0.1 % BSA作为保护剂。用包被缓冲液将孢子化巨型艾美耳球虫卵囊全抗原分别稀释至4 μg/mL(检测血清总IgY)、2 μg/mL(检测胆汁中分泌型IgA)、8 μg/mL(检测肠道中分泌型IgA)，100 μL/孔，置于4 ℃过夜；一抗，即被检样品的稀释倍数分别为1∶400(血清)、1∶400(胆汁)、1∶8(肠道)，100 μL/孔，37 ℃湿盒孵育1 h，同时以健康无球虫感染鸡只的血清为阴性对照；HRP-Goat anti-Chicken IgY-Fab和HRP-Goat anti-Chicken IgA酶标二抗的稀释倍数均为1∶10 000，100 μL/孔，37 ℃湿盒孵育1 h；显色液100 μL/孔，室温避光反应15 min，再加入终止液50 μL/孔，将ELISA反应板放入酶标仪中，读取OD 450 nm/630 nm值。

1.2.3 ELISPOT检测脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ水平：根据免疫程序，在35、47和57 日龄每组分别取5只鸡，无菌分离并纯化脾脏淋巴细胞，用无血清培养基避光条件下将细胞浓度调整至5×107个/mL。向PVDF板加入预湿液15 μL/孔，预湿10 min；扣去预湿液，加入Mouse-Anti-ChIFN-γ捕获抗体(2 μg/mL)100 μL/孔进行包板，4 ℃过夜；倾倒包被液，加入封闭液200 μL/孔，室温封闭2 h；倒掉封闭液，加入脾脏淋巴细胞100 μL/孔，每个样品做2个重复；加入孢子化巨型艾美耳球虫卵囊全抗原(5 μg/mL)，并设立阴性对照(培养基)和阳性对照(植物血凝素，phytohaemagglutinin，PHA)，10 μL/孔；将PVDF板放入41 ℃ CO2细胞培养箱，培养24 h。培养结束后，倒掉培养基和细胞，加入冰冷的去离子水200 μL/孔，冰浴10 min；加入洗液200 μL/孔，洗涤10次，在吸水纸上扣干；加入检测抗体(2 μg/mL)100 μL /孔，37 ℃孵育2 h；同上用洗液洗涤8次；加入亲和素(2 μg/mL)100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；同上用洗液洗涤8次；迅速加入AEC显色液100 μL/孔，避光显色15～45 min；待斑点生长到适合的大小之后，以去离子水洗涤2遍，终止显色过程；将板倒扣在吸水纸上拍干，之后取下保护层，放在通风的地方，室温静置10～30 min，将膜自然晾干。PVDF膜上显示的点代表分泌IFN-γ的特异性淋巴细胞。样品的实验结果=[(巨型艾美耳球虫抗原刺激值1-培养基阴性对照值1) + (巨型艾美耳球虫抗原刺激值2-培养基阴性对照值2)] / 2。

1.2.4 分别收集35～39、47～51和57～61日龄这3个时间段的粪便，检测每克粪便中卵囊数(Oocysts per gram，OPG)。

1.2.5 统计分析:各组样品的实验结果采用SPSS 11.5软件进行统计与分析，图表由GraphPad Prism 5软件绘制。

2 结果

2.1 巨型艾美耳球虫感染激发宿主产生的体液免疫反应和粘膜免疫反应

如图1-A所示，与对照组相比，实验组鸡只随感染次数的增加，其抗体水平逐渐升高。胆汁和肠道sIgA的动态变化与血清IgY的类似(图1-B和图1-C)，表明巨型艾美耳球虫3次间隔感染可以激发宿主产生较强的体液免疫应答和局部粘膜免疫应答。

图1 巨型艾美耳球虫激发宿主产生的抗体应答Fig. 1 The specific humoral immune responses of infected chickens在首次感染后5 d(35日龄)和11 d(41日龄)，二次和三次感染后5 d(47和57日龄)，分别采集各组鸡只外周血、胆汁和空肠组织，用ELISA分别检测血清中IgY(A)，胆汁(B)和肠道(C)中sIgA的水平。图中所示为均值±标准误，P>0.05表示差异不显著；P<0.05，以“*”表示差异显著。Sera, bile and intestinal content samples were collected at day 35, 41, 47 and 57 for the detection of IgY in sera (A), sIgA in bile (B) and intestinal content (C), respectively. Soluble antigen prepared from oocysts were used for the detection of E. maxima-specific antibodies. All values were showed by means ± SE. * indicates the significant difference (P<0.05).

2.2 巨型艾美耳球虫特异性细胞免疫反应

如图2所示，实验组鸡只随免疫程序的进行，其分泌IFN-γ的脾脏淋巴细胞数量逐渐增多，首次与二次感染相比差异极显著，二次与三次感染水平相当，各期实验组与对照组相比，均差异极显著。可见巨型艾美耳球虫3 次间隔感染可以激发宿主产生较高水平的细胞免疫反应。

2.3 巨型艾美耳球虫感染后鸡只卵囊排出量

感染鸡只在35～39、47～51和57～61日龄段的粪便OPG平均值分别为7 500、1 500和33，而无球虫对照组均无卵囊排出(图3)；第4次感染(82日龄)后无卵囊排出(结果未显示)。可见巨型艾美耳球虫3次间隔感染可诱导鸡只产生针对同源感染(剂量为5×104卵囊)的完全保护作用。

3 讨论

酶联免疫斑点(Enzyme-linked immunosorbent spot, ELISPOT)技术是一种能够从单细胞水平检测特异性抗体分泌细胞和特异性细胞因子分泌细胞的免疫技术，具有较高的稳定性、敏感性和特异性 (Yinetal., 2013)。由于ELISPOT不仅能够精准检测细胞因子的分泌水平，而且能有效地克服实时定量PCR及ELISA检测技术的不足(Tanguayetal., 1994; Kalyuzhny, 2005)，因此我们利用ELISPOT方法检测脾脏中针对巨型艾美耳球虫感染能够分泌IFN-γ的脾脏淋巴细胞，以此来反映针对巨型艾美耳球虫特异性和功能性的淋巴细胞的数量。

研究表明，IFN-γ能够增强单核细胞和巨噬细胞的活性，使其产生活性氧中间体，导致宿主细胞内的色氨酸降解，非特异性的清除胞内寄生虫，同时促进巨噬细胞释放IL-1β、TNF-α、NO等趋化因子，进而趋化大量的炎性细胞聚集到球虫入侵位点，消除球虫感染 (Pfefferkornetal., 1984; Lowenthaletal., 1997)。我们通过ELISPOT发现，随感染次数的增加，分泌IFN-γ的脾脏T淋巴细胞数量逐渐增多，说明巨型艾美耳球虫感染能够使机体产生更多的效应性T淋巴细胞。

图2 巨型艾美耳球虫感染鸡只产生分泌IFN-γ的T细胞检测Fig. 2 The detection of IFN-γ releasing T lymphocytes derived from E. maxima-infected chickensA. 各检测时间点代表鸡只的分泌IFN-γ的T细胞。“+”为阳性对照(PHA刺激)、“-”为阴性对照(未刺激)、“E.m”代表抗原刺激组(巨型艾美耳球虫抗原刺激)；B. 各期数据的统计结果，以均值 ± 标准误表示，不同的大写字母代表差异极显著(P<0.01)。A. Representative results for each group. + means PHA as the stimulator, - stands for the negative control, while E.m indicates the E. maxima antigen as stimulator. B. Statistic results from the ELISPOT assay. The number of IFN-γ releasing T lymphocytes was showed as value ± SE. The different capitals stand for significant difference (P<0.01).

图3 鸡只3次感染后的粪便卵囊数量Fig. 3 Fecal oocyst counting for chickens with 3 infections三次感染的剂量依次为5×102、5×103和5×104 个/只。图中所示为克粪便卵囊数量，以均值±标准误表示，不同字母之间代表差异极显著(P<0.01)。The doses for the first, second and third infection were 5×102, 5×103 and 5×104 per bird, respectively. The value of oocyst per gram (OPG) was expressed as Mean ± SE. Different capitals shown on top of each bar stand for the significant difference (P<0.01).

研究认为CD4+T细胞是球虫首次感染机体时发挥重要作用的效应细胞，而CD8+T细胞是二次感染或多次感染的效应细胞。CD4+T细胞能给CD8+T细胞提供重要的辅助性调节作用，CD8+T细胞能够杀死被感染的靶细胞，从而发挥有效的细胞免疫保护(Lillehoj, 1998; Yunetal., 2000)。Rothwell等(1995)人研究发现，巨型艾美耳球虫首免后5 与11 d，在鸡只小肠的上皮内层的CD8+T细胞数量出现高峰，而仅在二免后1 h，鸡只的上皮内层就出现新的CD8+T细胞高峰，而巨型艾美耳球虫首免后3～5 d与11 d，在鸡只小肠的固有层出现CD4+T细胞高峰，而在二免后3 和48 h，鸡只的固有层出现新的CD8+T细胞高峰(Rothwelletal., 1995)。本研究发现，在第3次感染后5天，各组鸡只的肠道T细胞亚群分布也发生变化，与对照组相比，实验组CD3+T细胞比例增加，CD4+和CD8+T细胞比例不变，但实质上CD4+和CD8+T细胞数量上有所增加(数据未显示)，与上述研究结论相似。

上述研究结果表明，巨型艾美耳球虫的强免疫原性能够激发宿主产生较高水平的CD4+和CD8+T细胞，进而激发宿主产生高水平的细胞免疫应答。