艾灸肺俞和心俞对慢性心力衰竭大鼠心室质量指数及心肌组织TNF－α、IL－6mRNA表达水平的影响

王 茎，曾永蕾，武凤琴，孙瑞瑞，陈 静

（1.安徽中医药大学中医临床学院，安徽 合肥 230038；2.安徽中医药大学第二附属医院，安徽 合肥 230061；3.安徽中医药大学研究生部，安徽 合肥 230038）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）病变机制较为复杂。近年来研究表明，心室重塑是其发生发展的关键［1］，而免疫和炎性递质在心力衰竭的发生及进展过程中起着重要的作用［2］。肿瘤坏死因子－α（tumor necrosis factorα，TNF－α）、白细胞介素－6（interleukin－6，IL－6）作为炎性细胞因子，可长期影响心肌组织的重塑，参与CHF的病理生理过程［3］。艾灸对免疫系统［4］和心血管系统［5］具有良好的调整作用，且艾灸具有容易操作、不良反应少、作用显著等优势。本实验以心室质量指数及TNF－α、IL－6mRNA表达水平作为观测指标，拟从免疫炎症角度，初步探讨艾灸肺俞、心俞对CHF心室重塑的影响机制。

1 材料

1.1 动物 健康SD大鼠35只，雄性，SPF级，体质量180～220g，由安徽中医药大学实验动物中心提供。

1.2 主要仪器 ABI－2720型PCR仪：美国应用生物系统公司；Tanon 3500型电子凝胶成像系统：上海天能公司。

1.3 试剂和药物 RNA抽提试剂盒、逆转录试剂盒及 TNF－α、IL－6、β－actin特异性引物均为江苏省南京诺维赞公司产品，其序列及扩增长度见表1。阿霉素（adriamycin，ADR）：浙江海正药业股份有限公司生产，批号 H33021980，每支10mg。卡托普利：上海旭东海普药业有限公司，生产批号H31020564，每片25mg。

表1 TNF－α、IL－6、β－actin扩增引物序列及产物长度

2 方法

2.1 模型复制 采用ADR隔日腹腔注射的方法［6］复制CHF模型，ADR长期小剂量累积给药，可诱导严重的CHF模型，且可靠简便［7］。SD大鼠适应性喂养1周后进行模型复制，剂量依次为1、2、3、4mg／kg，每个剂量给药2次，依次递增，隔日1次，共8次，累积量20mg／kg，持续15d。正常喂养3周，每日密切观察大鼠精神状态、活动、进食饮水量、体质量及呼吸频率变化。以左心室湿质量／体质量比值和右心室湿质量／体质量比值分别代表左心室质量指数（left ventricular mass index，LVMI）和右心室质量指数（right ventricular mass index，RVMI），以反映心室重构情况［8］，结合大鼠一般情况及心率，作为模型复制成功的标准［9］。

2.2 动物分组 将35只大鼠随机抽取28只用于模型复制，另7只作正常组。正常喂养3周，将28只模型大鼠分为4组，即模型组、西药组、艾灸组、艾灸加西药组。

2.3 治疗方案 模型复制3周后开始进行。

2.3.1 西药组：给予卡托普利混悬液（25mg／kg）灌服，每日1次，连续3周。

2.3.2 艾灸组：取双侧肺俞、心俞，定位参照《实验针灸学》大鼠标准穴位图谱［10］，行艾条温和灸，用特制小艾条在距离穴位1～2cm处施灸，每次每穴各灸15min，每日1次，共3周。

2.3.3 艾灸加西药组：先给予卡托普利（25mg／kg）混悬液灌服，再用艾条温和灸肺俞、心俞，每日1次，连续3周。

2.3.4 模型组和正常组：正常喂养，不进行任何治疗。期间注意观察各组大鼠行为特征。

2.4 指标观察

2.4.1 心室肌组织取材与保存：将大鼠称质量，用4%戊巴比妥钠溶液（40mg／kg）腹腔注射麻醉后，将其仰卧固定于鼠台，腹主动脉放血处死，开胸暴露心脏，结扎出入心脏大血管，于右心室剪一小口，用4℃预冷的生理盐水逆行灌注，冲洗心室腔至冲洗液无血性液体。取出心脏，用清洁滤纸吸干水分后，分别称取左、右心室（包括室间隔）湿质量，全过程于冰浴中进行。计算左、右心室湿质量／体质量比值，为心室质量指数。处理后心肌冻存于液氮中，液氮冷冻后转存于－70℃超低温冰箱，用于RT－PCR检测。

2.4.2 RT－PCR 法检测心肌组织TNF－α、IL－6 mRNA水平：①总RNA提取：按所购总RNA抽提试剂盒说明进行。②逆转录：取2μl RNA溶液做模板，总反应体积为55μl，具体步骤按逆转录试剂盒说明书进行。③PCR扩增 TNF－α及IL－6：PCR反应总体积50μl，预变性95℃，3min，变性98℃，10s，退火58℃15s；延伸72℃，30s；30个循环，末次循环后再72℃延伸1min。β－actin反应条件，同目的扩增产物的反应条件。1%琼脂糖凝胶电泳，在电子凝胶成像仪上检测PCR产物。结果以TNF－α及IL－6与同组β－actin电泳带光密度的比值，作为该组标本的基因表达的相对值。

2.5 统计学方法 运用SPSS17.0统计软件进行统计分析。分析前对数据进行正态性检验，连续型变量采用“均数±标准差（±s）”进行统计学描述。多组均数比较采用单因素方差分析，两组之间均数比较采用LSD分析（方差齐时）或Tamhane'sT2分析（方差不齐时）。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠一般情况 从第8天开始，与正常组比较，模型组大鼠陆续出现精神萎靡、活动减少、倦卧、反应迟钝、呼吸困难，体质量下降等现象。从治疗第2周开始，治疗组大鼠气喘、食欲下降、萎靡倦怠等有不同程度改善，大鼠反应性提高；模型组上述症状依然存在，总体上有加重趋势；正常组大鼠活动、反应灵敏性如常，体质量上升。

3.2 各组大鼠心室肌质量指数比较 与正常组比较，模型组大鼠LVMI和RVMI显著增高（P＜0.01）；与模型组比较，西药组、艾灸组、艾灸＋西药组LVMI和RVMI显著降低（P＜0.05，或P＜0.01）。结果表明艾灸能显著降低心室肌质量指数。见表2。

表2 各组大鼠心室肌质量指数比较（±s）

表2 各组大鼠心室肌质量指数比较（±s）

注：与正常组比较，＊＊P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

正 常7 2.136±0.252 0.534±0.063模 型 7 2.823±0.314＊＊ 0.724±0.080＊＊西 药 7 2.450±0.291△ 0.615±0.073△艾 灸 7 2.490±0.355△ 0.627±0.090△艾灸＋西药 7 2.194±0.280△△ 0.550±0.070△△

3.3 各组大鼠心肌组织 TNF－α、IL－6mRNA 相对表达水平比较 与正常组比较，模型组大鼠TNF－α、IL－6mRNA相对表达水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，3个治疗组 TNF－α、IL－6mRNA 相对表达水平显著降低，（P＜0.01）。见表3、图1。

表3 各组大鼠心肌组织 TNF－α、IL－6mRNA相对表达水平比较（±s）

表3 各组大鼠心肌组织 TNF－α、IL－6mRNA相对表达水平比较（±s）

注：与正常组比较，＊＊P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01。

正 常7 1.005±0.128 1.018±0.376模 型 7 5.024±0.640＊＊ 5.189±0.749＊＊西 药 7 2.439±0.346△△ 2.546±0.344△△艾 灸 7 2.520±0.471△△ 2.988±0.471△△艾灸＋西药 7 2.334±0.327△△ 2.414±0.460△△

图1 RT－PCR检测各组大鼠心肌组织TNF－α、IL－6mRNA相对表达水平

4 讨论

关于CHF发病和心室重塑形成机制的研究，正不断深入。近年研究发现，CHF不仅存在血流动力学紊乱，更重要的是激活了包括交感神经系统和肾素－血管紧张素－醛固酮系统在内的一系列神经内分泌反应［11－12］。炎性细胞因子在CHF心室重塑的演变过程中，扮演着非常重要的角色。高水平表达的炎性细胞因子TNF－α、IL－6，作用于细胞膜上的特殊受体，导致细胞凋亡，引起心脏间质纤维化、心肌收缩力下降和心室重构等。血浆中TNF－α、IL－6水平增高的患者，存在病死率增高的趋势。TNF－α、IL－6可长期影响心肌重塑，参与CHF的病理生理过程。它们通过促使左心室扩大、降低左心室收缩能力和诱导凋亡使心脏功能减退［3］。

本实验采用ADR隔日腹腔注射的模型复制方法。有研究［7］证实，ADR作为一种高效蒽醌类广谱抗肿瘤药物，其心脏毒性作用机制表现为抑制谷胱甘肽过氧化物酶活性，破坏细胞膜的结构和功能，影响线粒体的能量代谢，随其剂量在动物体内积累增加而导致心肌细胞变性坏死，从而引起严重的心力衰竭，多用于复制慢性心力衰竭模型。而腹主动脉半缩窄术构建的是舒张性心力衰竭模型［6］，手术操作难度大，缩窄程度与结扎很难一致，病死率较高。预实验表明，ADR隔日腹腔注射的方法复制模型的效果较好，病死率低。

心俞是心的背俞穴，具有调理气血、养心安神、宁心定志之功，为历代医家治疗心胸病症之要穴。现代研究［13］表明，针刺不仅能有效地缓解患者的症状，而且能影响血流动力学参数。肺俞是肺的背俞穴，具宣肺通气、疏调上焦之功。现代研究［14］证明，针刺肺俞穴能明显改善肺功能，增大肺通气量，主要治疗呼吸系统疾病。肺与心表现为气血关系，故肺俞可用于治疗与气血关系最为相关的心血管疾病。

艾灸肺俞、心俞能显著改善心功能和降低血浆内皮素水平［15］，说明艾灸对神经内分泌系统和心血管系统有良性调整作用。本课题在此基础上，进一步观察心室质量指数，并检测心室肌 TNF－α、IL－6 mRNA表达水平，探讨艾灸对慢性心力衰竭心室重塑的影响。实验结果显示，3个治疗组心室质量指数及 TNF－α、IL－6mRNA 表达水平显著降低。有研究［16］表明，艾灸刺激穴位后，可引起机体神经－内分泌系统功能的变化，释放某些生物活性物质，激活靶细胞信号转导。本研究提示，艾灸肺俞、心俞穴对缓解CHF心室重塑、改善心肌肥厚有着积极意义，为临床治疗CHF拓宽了思路。有关艾灸对CHF心室重塑的影响及其相关的神经－内分泌－免疫机制，还有待进一步深入探讨。

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