响应面法优化龙牡宁神汤中君臣药的提取工艺

候深东，曲有乐，闻正顺，王晓波

（浙江海洋学院食品与医药学院,浙江舟山 316022）

响应面法优化龙牡宁神汤中君臣药的提取工艺

候深东，曲有乐，闻正顺，王晓波

（浙江海洋学院食品与医药学院,浙江舟山 316022）

以龙牡宁神汤组方为原料,选取影响中药提取率的五个因素,即料液比、浸泡时间、提取时间、提取温度、提取次数进行单因素试验,在此基础上选取三个因素三个水平,以中药浸膏得率为响应值,进行响应面分析,优化其君臣药水提工艺,为工业化生产,开发新剂型提供理论依据;本研究实际提取率与理论值恰合良好,确定的最佳提取条件:浸泡时间为45 min,料液比为1：15,提取时间为50min,提取温度为100℃,反复提取2次,首次提取率为8.15%,操作简单易行,为中药开发奠定了基础。

龙牡宁神汤;提取率;响应面分析法;工艺优化

龙牡宁神汤主治癫狂症(精神分裂症),有重镇养心,安神之功效,历史悠久,始载见自《浙江中医杂志》,方中以生龙骨平肝潜阳为君药,镇静安神,臣药以生牡砺与龙骨相须为用,以加强滋阴潜阳重镇的作用,佐以甘麦大枣汤益心气,养心阴,安神,诸药配伍,共奏重镇安神,益气养心之功[1]。

响应面是指响应变量η与一组输入变量(ζ1，ζ2，ζ3...ζk)之间的函数关系式:η=f（ζ1，ζ2，ζ3...ζk）。响应面分析法[2-3]（response surfacemethodology,RSM）是一种利用合理的试验设计方法并通过实验得到一定数据,采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系,通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数,解决多变量问题的一种统计方法,具有实验周期段、精密度高、交互作用分析简单等特点,广泛应用于化工、医药、食品等领域[4-5]。本实验在单因素试验基础上,利用响应面法优化龙牡宁神汤中君臣药的提取工艺,为后续研究提供理论基础。

1 试约与仪器

试药:生龙骨、生牡砺、积实、竹茹(所需中药材均购自于浙江舟山同仁堂药店)。

仪器:中药粉碎机(DFY-400,温岭市林大机械有限公司)、水浴锅(HWS12型,上海一恒科学仪器有限公司)、电子天平(BSA323S,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)、电热恒温鼓风干燥箱(DGG-9140A型,上海森信实验仪器有限公司)、烧杯、培养皿、冷冻干燥机(FD-1E,北京德天佑科技发展有限公司)、低速离心机(TD5K,长沙东旺实验仪器有限公司)、EYELA旋转蒸发仪(N-1100,上海爱朗仪器有限公司)。

2 实验方法、结果与分析

2.1 中药浸膏的制备

工艺流程:中药→清洗→烘干→干燥器冷置→粉碎→按处方量混合→水提法→离心操作→上清液→抽滤→滤液蒸发浓缩→低温冷冻→冷冻干燥→中药浸膏[6]。中药浸膏得率计算公式:中药浸膏得率=(浸膏重量/中药材重量)×100%。中药处方比例见表1。

表1 中药处方比例Tab.1 Proportion of Chinese traditionalmedicine prescription

2.2 单因素试验

为了考察提取过程中各影响因素对龙牡宁神汤中君臣药提取率的影响,本研究分别对溶媒用量、浸泡时间、煎煮时间、提取次数等参数进行单因素试验。根据试验结果,从中选择3个主要影响提取率的因素用于后续响应面法分析,并大致估计响应面设计实验的中心试验点和各因素的取值范围。

2.2.1 料液比对龙牡宁神汤中君臣药提取率的影响

由图1可知,当溶媒用量从8倍增加到14倍时,中药浸膏的提取率呈不断增加趋势,其原因可能是因为随着溶剂的增多,溶解出来的中药成分越多,但溶媒用量从14倍增加到18倍过程中中药的提取率没有明显变化,其原因可能是受药材中所含成分含量的限制,因此确定的最佳溶媒用量为14倍溶媒。

2.2.2 浸泡时间对龙牡宁神汤中君臣药提取率的影响

图1 料液比对提取率的影响Fig.1 Effects of ratio ofmaterial towater on extraction rate

从图2可以看出,随着浸泡时间的变化,龙牡宁神汤中君臣药提取率维持在6.80%左右,并没有明显的变化,可见浸泡时间不是影响提取率的主要因素,为了让中药材充分溶胀在实际提取过程中选择浸泡45min。

2.2.3 提取时间对龙牡宁神汤中君臣药提取率的影响

从图3可以看出,煎煮时间对龙牡宁神汤中君臣药提取率有明显影响,在煎煮40min前,提取率随时间的延长不多增高,煎煮40min后,提取率随提取时间的延长反而减少,究其原因可能是中药中部分物质不断分解或挥发所致,因此确定的最佳提取时间为45min。

2.2.4 提取温度对龙牡宁神汤中君臣药提取率的影响

由图4可知,随着提取温度的不断升高,组方中药浸膏的提取率也不断增加,在100℃左右达到最大值,其原因可能是因为随着温度的增高,浸膏组分在水溶液中的扩散速率和溶解度增大有关。

2.2.5 提取次数对龙牡宁神汤中君臣药提取率的影响

由图5可知,龙牡宁神汤中君臣药的提取率随着煎煮次数的增加,提取率不断下降,重复提取3次时,耗费大量能源和时间,其提取率已不足1%,因此最佳提取条件为重复提取2次。

图2 浸泡时间对提取率的影响Fig.2 Effects of soaking time on extraction rate

图3 提取时间对提取率的影响Fig.3 Effects of decoction time on extraction rate

图4 提取温度对提取率的影响Fig.4 Effects of temperatures on extraction rate

图5 提取次数对提取率的影响Fig.5 Effects of extraction times on extraction rate

2.3 响应面分析法实验设计

2.3.1 响应面试验因素水平和中心组合实验设计

根据2.2中单因素试验的实验结果,选择溶媒用量、煎煮时间、提取温度三个影响因素,设置三个水平,根据Box-Behnken中心组合实验原理[7-8],进行实验因素及水平设计见表2。

表2 响应面试验因素及水平设计Tab.2 Factors and levels in response surface design

根据表2确定的因素水平,浸泡45min,提取2次,以中药浸膏得率（Y）为响应值（Response）,借助软件Design-Expert7.1.6 Trial进行响应面优化设计,具体实验方案及实验结果见表3。

表3 响应面Box-Behnken中心组合实验设计及结果Tab.3 _Response surface Box-Behnken design and corresponding

由表3可以看出本实验设计共需要做17个实验,其中前12个实验为析因实验,后5个实验为中心实验。这17个实验点包括析因实验和零点实验,其中由3个影响因素所构成的三维立体图形的顶点为析因点,三维图形的中心区域为零点,中心试验要重复5次,以估计实验误差。

2.3.2 实验结果的ANOVA分析

表4 回归模拟方程的ANOVA分析结果Tab.4 ANOVA analysis of the developedregression equation

2.3.3 响应面图形解析

根据2.3.2得出的回归方程,做出3个影响因素之间的响应面图,预测3个影响因素对中药浸膏得率的影响,具体见图6～8。

由图6～8可以看出,在各影响因素取值范围内存在极大值,既是三维立体图形的最高点,同时也是平面等值线图的中心点。从图6可以看到,在0值以下,随着料液比和提取时间的不断提高,中药浸膏得率不断增加,其原因可能是因为随着时间的增加溶解在水中的中药浸膏不断增加,但从等高线可以看出料液比和提取时间的交互作用并不明显。

图6 水料比X1（g/mL）和提取时间X2（t/min）对浸膏得率（Y/%）影响的响应面图Fig.6 Response surface and contour plots for the effects of cross interaction between ratio ofmaterial to water X1（g/mL）and decoction time X2（min）on extraction rate（Y/%）

由图7可以看出,中药浸膏得率随着水料比和提取温度的升高二不断增加,但提取温度对提取率的影响显著高于料液比,从平面图形可以看出两影响因素之间交互作用明显,和统计分析结果相一致。

图7 水料比X1（g/ml）和提取温度X3（T/℃）对浸膏得率（Y/%）影响的响应面图Fig.7 Response surface and contour plots for the effects of cross interaction between ratio ofmaterial to water X1（g/m l）and temperatures（T/℃）on extraction rate（Y/%）

由图8可以看出,提取温度和提取时间对浸膏得率的影响都很明显,但两者的交互作用不是太强,结合图6、图7可以看出3个影响因素中,提取温度对浸膏得率的影响程度最大,提取时间次之,料液比较前两者影响较弱。

图8 提取时间X2（t/min）和提取温度X3（T/℃）对浸膏得率（Y/%）影响的响应面图Fig.8 Response surface and contour plots for the effects of cross interaction between decoction time X2（t/min）and temperatures（T/℃）on extraction rate（Y/%）

由响应面模型可以得出,龙牡宁神汤中君臣药的最优提取工艺条件为:用14.53倍的溶媒,浸泡45 min,在96.57℃条件下提取50.53min,反复提取2次,第一次提取浸膏得率为7.94%。

为了验证本实验得到的最佳工艺条件[11],同时考虑到实际操作和生产的便利,以料液比为1：15,提取时间为50min,提取温度为100℃,做3次平行试验,得到中药浸膏平均得率为8.15%,与预测值相比高了1.38%,说明本研究优化的工艺条件可靠。

表5 工艺优化后预测值和实际值Tab.5 Predicted and observed values of optimal formulations（n=3）

3 结论

本研究通过单因素试验对影响龙牡宁神汤君臣药提取率的可能因素进行了分析,在基础上选择三个主要因素3个水平,进行了响应面优化实验,验证实验与理论值相吻合,确定的最终提取工艺条件为:浸泡时间为45 min,料液比为1：15,提取时间为50 min,提取温度为100℃,反复提取2次,首次提取率为8.15%,为中药实际开发和有效利用奠定了理论基础。

[1]李培英.中医名方新用[M].郑州：河南科学技术出版社，2008：246.

[2]XU JH，WEIC.Optimization of extraction process of crude polysaccharides from wild edible BaChu mushroom by response surfacemethodology[J].Carbohydrate Polymers，2008，72（1）：67.

[3]KHURIA I，MUKHOPADHYAY S.Response surfacemethodology[J].Wiley Interdisciplinary Reviews：Computational Statistics，2010，2（2）：128.

[4]刘 听，马 涛，王 勃，等.响应面法优化脉冲强光对面包表面细菌的杀菌工艺[J].食品科学，2014，35（18）.

[5]彭晓霞，路莎莎.响应面优化法在中药研究中的应用和发展[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（19）：296.

[6]董德云，关 健，金日显，等.带式真空干燥技术在中药浸膏干燥过程中的研究和应用[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（13）：310.

[7]GAN C Y，LATIFF A A.Optimization of the solvent extraction of bioactive compounds from Parkia speciosa pod using response surfacemethodology[J].Food chemistry，2011，124（3）：1 277.

[8]DASGUPTA D，SUMAN SK，PANDEY D，et al.Design and optimization of ethanol production from bagasse pith hydrolysate by a thermotolerant yeast Kluyveromyces sp.IIPE453 using response surfacemethodology[J].SpringerPlus，2013，2（1）：1.

[9]LIN Y S，WANG J，WANG X M，et al.Optimization of butanol production from corn straw hydrolysate by Clostridium acetobutylicum using response surfacemethod[J].Chinese Science Bulletin，2011，56（14）：1 422.

[10]JAIN M，GARG V K，KADIRVELU K.Investigation of Cr（VI）adsorption onto chemically treated Helianthus annuus：Optimization using Response Surface Methodology[J].Bioresource technology，2011，102（2）：600.

[11]胡成旭，侯欣彤，冯永宁，等.响应面法优化云芝多糖提取条件的研究[J].食品工业科技，2007，28（7）：124.

Optim ization of Extraction Technique of the Principal and M inister Drug of Longmu Ningshen Decoction via Response Surface M ethodology(RSM)

HOU Shen-dong，QU You-le，WEN Zheng-shun，et al
(School of Food and Pharmacy，Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316022，China)

In the present study，Longmu ningshen decoction was used as raw materials，select five factors affecting the herbal extracts rate，namely the ratio ofmaterial to water,soaking time，extraction time，extraction temperature，extraction times，to do single-factor experiments；Then based on the results，select three foremost factors（ratio ofmaterial to water，decoction time and temperature）at three levels to do response surface analysis.The extraction rate was taken as the response value.This study aims to improve the extraction rate and provide a theoretical basis for industrial production and development of new formulations.This experiment is simple，feasible and the predicted and observed values are identical.The obtained optimum extraction parameters are soaking time 45 min，ratio ofmaterial to water 1：15，decoction time 50 min，temperature 100℃，extract 2 times and the first time extraction rate is 8.15%.

Longmu ningshen decoction；extraction rate；response surfacemethodology；processoptimization

R943.1

A

1008-830X（2014）05-0414-06

2014-04-28

候深东(1990-),男,山东陵县人,硕士研究生,研究方向:海洋药物开发与利用.E-mail：houshendong@126.com

曲有乐(1990-),男,教授.E-mail：YouLe1960@163.com