正交试验法优选土家药夜关门中D-松醇提取工艺

郜红利，张 方

(1.湖北民族学院中医药学院，湖北恩施 445000;2.恩施自治州优抚医院，湖北恩施 445000)

夜关门为豆科植物截叶铁扫帚Lespedeza cuneata(Dum.Cours.)G.Don的全草，以其白天叶子迎阳张开，傍晚自然合拢，故而在土家族称为“夜关门”［1］。夜关门作为土家苗药的珍贵药材，其性微温，味辛微苦，具有散瘀消肿，补肝益肺，安神之功效，可用于治疗遗精、哮喘、跌打损伤、失眠等［2-7］。现代研究表明，夜关门中含有黄酮类化合物、D-松醇、木质素、松脑、酚性成分、鞣质、含羞草碱和含羞草苷等［8］。

D-松醇 (右旋肌醇甲醚)，又名“咳宁醇”，该化合物具有类似于胰岛素的作用，用于治疗由胰岛素耐药性引起的相关疾病［9］。D-松醇还能够增强肌肉组织的功能，增加肌肉中糖元的形成，刺激肌肉组织中葡萄糖的运输，且具有止咳、祛痰作用及典型的抗炎活性和抗急性水肿作用［10-11］。D-松醇还可以促进人体对肌酸的吸收，因此，近年来本品被广泛应用于医药原料和保健品添加剂。

本项目拟采用乙醇溶液提取，通过正交试验设计，考察提取温度、乙醇体积分数、提取时间、溶剂用量对土家苗药夜关门中D-松醇的影响，确定最佳提取工艺条件，为民族药夜关门的开发提供依据。

1 仪器与试药

BP211D电子天平 (d=0.01 mg，德国赛多利斯);Waters 515液相色谱仪及Waters 2420蒸发光散射检测器(美国Waters公司);N3000色谱工作站 (浙江大学);恒温水浴锅 (精科华瑞);RE-51旋转蒸发仪 (上海荣亚生化仪器厂)。

夜关门采集于湖北省恩施州利川市佛宝山森林自然保护区，经朱敏英副教授鉴定为豆科植物夜关门全草;D-松醇对照品 (上海索莱宝生物科技有限公司，批号:10284-63-6);乙腈 (色谱纯，美国默克公司);蒸馏水;其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 D-松醇定量测定方法建立

2.1.1 溶液配制

2.1.1.1 供试液的制备 取夜关门全草，粉碎过80目筛，于鼓风干燥箱中干燥至恒重。称取夜关门粉末10 g，加150 mL 95%乙醇溶液于80℃回流提取3次，每次30 min，合并滤液，减压浓缩干后用乙醇溶解并定容至100 mL，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液为供试品溶液。

2.1.1.2 对照品溶液的制备 精密称取于五氧化二磷干燥器中干燥至恒重的D-松醇对照品20.02 mg，置于5 mL量瓶中，加乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，即得对照品溶液。

2.1.1.3 阴性对照溶液制备 取溶解对照品的乙醇，过0.45 μm微孔滤膜，即得阴性对照品溶液。

2.1.2 色谱条件［12］Cosmosil Sugar-D色谱柱 (4.6 mm×250 mm);流动相为乙腈-水 (80∶20，V∶V)，体积流量1.0 mL/min;柱温30℃;Waters 2420蒸发光散射检测器检测，气压25 kPa;载气N2，漂移管温度设定为55℃;喷雾器级别为60%;增益值100。在上述色谱条件下进样10 μL，结果见图1。结果表明，D-松醇峰形良好，与杂质能较好的实现分离 (分离度＞1.5)，阴性无干扰。

图1 夜关门液相色谱图

2.1.3 标准曲线及线性关系 精密吸取2.002 mg/mL的对照品溶液，分别加乙醇溶解定容至 0.04、0.1001、0.2002、0.4004、1.001、2.002 mg/mL。按 “2.1.2”项下色谱条件进样，每个质量浓度进样3次，以质量浓度C为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行回归分析，得线性方程为Y=32624.7682C+1163.4425，r=0.9998，表明D-松醇在0.04～2.002 mg/mL范围内，线性关系良好。

2.2 提取工艺研究

2.2.1 单因素实验 以D-松醇量为指标，考察提取温度、乙醇体积分数、提取时间、溶剂用量对提取工艺的影响。

2.2.1.1 提取温度 精密称取3 g夜关门粉末5份，加水30 mL，分别于40、60、70、80、100℃下浸提3次，每次1 h后过滤，将滤液转入到100 mL的量瓶中加乙醇稀释至刻度，微孔滤膜滤过，测定D-松醇，结果显示，60、70、80和100℃时量均较高，故选用70、80、100℃作为正交试验水平。

2.2.1.2 乙醇体积分数 精密称取3 g夜关门粉末5份，分别加入0%、25%、50%、75%、95%的乙醇溶液30 mL，60℃下浸提3次，每次1 h后过滤，将滤液转入到100 mL的量瓶中加乙醇稀释至刻度，微孔滤膜滤过，测定D-松醇量。结果显示，D-松醇量随着提取溶剂中乙醇体积分数的增大而增大，故选用50%、75%、95%作为正交试验水平;

2.2.1.3 提取时间 精密称取3 g夜关门粉末5份，分别加入30 mL水，60℃下浸提3次，每次30、60、90、120、150 min后过滤，将滤液转入到100 mL的量瓶中加乙醇稀释至刻度，微孔滤膜滤过，测定D-松醇。结果显示，D-松醇随着提取时间的变化不明显，从成本考虑，故选用30、60、90 min作为正交试验水平;

2.2.1.4 溶剂用量 精密称取3 g夜关门粉末5份，分别按料液比1∶2、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20加入50%乙醇溶液，60℃下浸提3次，每次1 h后过滤，将滤液转入到100 mL的量瓶中加乙醇稀释至刻度，微孔滤膜滤过，测定D-松醇。结果显示，D-松醇量随着提取溶剂用量的增大而增大，提取越完全。综合成本考虑，故选用料液比1∶5、1∶10、1∶15作为正交试验水平。

2.2.2 正交试验优选提取工艺 在单因素实验的基础上，以D-松醇量为指标，考察提取时间 (A)、溶剂用量 (B)、提取温度(C)、乙醇体积分数 (D)对提取工艺的影响。提取方法为精密称取夜关门粉末10 g，按照L9(34)正交试验设计，药液减压浓缩至干，加乙醇定容至100 mL，测定其中D-松醇。正交试验因素水平表见表1，结果和方差分析见表2、表3。

表1 正交试验因素水平

表2 正交试验结果

表3 方差分析

2.2.3 正交试验结果分析 由表2和表3可以看出，极差大小显示各因素主次顺序为D＞B＞C＞A，最佳提取条件为A1B3C2D3，以A因素为误差项的方差分析结果表明，提取溶剂中乙醇的体积分数和提取溶剂的用量对夜关门中D-松醇的提取效果有显著意义 (P＜0.05)，提取温度和提取时间对夜关门中D-松醇的提取效果无显著性意义 (P＞0.05)。考虑各因素影响主次，结合效能和生产成本，最终确定最佳工艺条件为A1B3C2D3，即加15倍量95%乙醇，80℃下回流提取3次，每次30 min。

2.3 优选工艺验证试验 精密称取约10 g干燥至恒重的夜关门粉末5份，加150 mL 95%乙醇，回流提取3次，每次30 min。合并提取液，减压浓缩干，以95%乙醇溶解并定容至100 mL量瓶中，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，按“2.1.2”项下色谱条件进样，每个样品进样3针，以平均峰面积计算D-松醇。结果见表4。

表4 验证试验结果

结果表明，该提取工艺与正交试验结果基本一致，该工艺合理可行，稳定性较好。

3 讨论及结论

3.1 预实验考察了药材粉碎粒度对提取工艺的影响，实验结果是粒度小于80目内对D-松醇提取率的影响不大，呈现持平的趋势。

3.2 实验从是否采用浸泡以及浸泡时间的长短对提取率进行比较，取5份夜关门样品，1份不采取浸泡直接提取，另4份置于室温下加15倍量水浸泡，浸泡时间分别为0.5 h、1 h、2 h、4 h后进行提取，后进行测定。得知提取到的D-松醇量比不浸泡的相差不大，故本实验选取最佳提取工艺采用不浸泡。

3.3 基于D-松醇具有重要的应用价值，以及目前的提取工艺所存在的弊端，本实验以D-松醇为指标，通过L9(34)正交试验，确定了夜关门中D-松醇的最佳乙醇回流提取工艺，即加15倍量95%乙醇，80℃下回流提取3次，每次30 min。结果显示，此提取工艺稳定、可重复性高，流程简单，操作性强，监测手段也常用，能够用来进行研究D-松醇提取工艺，优化D-松醇的质量控制。这一关键技术性提取工艺，为今后充分利用夜关门资源以及进一步开发夜关门制品提供了理论依据，具有重要的现实意义。

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