显微组织化学定位在中药研究中的应用

林丽，施晓龙，高素芳，陈红刚

(1.甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省高校中藏药化学与质量研究省级重点实验室，甘肃 兰州 730000)

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林丽，高级实验师，研究方向：中药鉴定及中药资源可持续利用；Tel：(0931)8765304，E-mail：xrhlin@sina.com

显微组织化学定位在中药研究中的应用

林丽1，2*，施晓龙1，高素芳1，陈红刚1

(1.甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省高校中藏药化学与质量研究省级重点实验室，甘肃 兰州 730000)

以中药显微鉴定和组织化学动态定位的相关研究为基础，从显微组织化学前沿研究、显微组织化学特征性反应、显微组织化学定位等方面进行详细综合论述，指出显微化学定位在组织结构研究中的优势，为中药资源的开发利用提供方法学技术指导，同时也为中药品质鉴定提供新的研究思路和方法。

显微化学；组织定位；中药材

显微组织定位是在中药有效成分鉴定明确的条件下，有针对性地选择能与有效成分产生沉淀、结晶或特殊颜色的化学试剂进行染色反应，运用显微镜观察来确定这些物质存在部位和分布情况。中药有效成分是植物组织细胞自身代谢的产物，其中包括分泌细胞对一些物质的分泌和具有特殊功能细胞对一些物质的合成，使得显微组织化学在植物组织中有效成分的定位研究发挥出独特的优势。目前显微组织化学定位主要应用于临床方面，它对精细病变组织切片进行定位观察，以此来辅助诊断肿瘤细胞是否扩散，确定治疗效果。显微组织化学定位也可以用于药用植物有效成分组织中的定位研究，确定其具体存在部位和动态转移途径，对中药材品种的选育、栽培及其品质的鉴定提供科学指导。

科研人员尝试借助先进的仪器设备，运用植物组织切片技术，在药用植物组织定位取得相应的研究成就，从而促使该方法在分子研究领域的先进性不断凸显，可以预测其具有广阔的发展前景。笔者通过检索近期国内外相关研究文献，综合分析显微化学定位在中药研究中的应用，探索植物有效成分的合成途径、代谢规律，为今后中药品质鉴定提供科学依据。

1 显微组织化学的发展历程

显微组织化学方法最早出现在化学研究领域的一些化学反应中，通过对化学反应的生成物进行染色处理制成装片后借助显微镜观察精细组织结构，特别在有机化学研究领域对有机物的研究做出巨大贡献，从而推动了化学研究的发展。同时我们还通过资料可以找到显微化学方法的显微化学定位能够对中药中的一些特征性物质进行定位确定，探索植物有效成分的合成途径、代谢规律，具有很大的发展潜能，为今后中药品质鉴定提供科学依据。因为其分散凌乱并没有形成一定的研究体系，因而也没有引起其他学科科研人员的足够重视。直到苏联科学家德日阿帕利捷的《显微化学实验指导手册》出版[1]，使显微化学研究有了明确的研究方向。随着显微组织化学方法的逐渐成熟，也逐步应用在组织细胞形态学方面的研究上，因为操作简单、快捷，实验结果可信度高等优势，更好地完善了组织细胞形态学研究体系，形成组织化学研究方法。但是对一些生理、生命现象，组织化学不能更好地进行合理解释。研究人员开始尝试显微化学从组织化学的学科主体进行分离，经过不断发展完善，显微组织化学在某些方面可以代替组织化学来研究组织或细胞中的化学组成、定位与定量以及代谢状态，能够更好地联系细胞形态结构、化学成分、功能，来了解组织或细胞的代谢变化[2]，而且在一些新技术、新仪器的相继出现后广泛用于这一科研领域。药用植物显微组织定位在药物鉴别研究方面取得相应成就，其应用最广泛的是在组织结构基础上对中药材进行鉴定来辨别真伪，而随着各项技术的不断成熟和对药用资源优化应用的要求，人们逐渐寻找有效成分积累部位和最大积累量之间的相关性规律，为药材的采收、加工、种属鉴定及质量评价提供依据。

2 显微组织化学在药用植物研究中的技术方法及应用

2.1 显微组织化学在中药不同组织及成分鉴别中常用的检测方法

显微组织化学方法是目前药用植物研究中最常用的方法之一，常用间苯三酚-盐酸(或硫酸)反应、苯胺反应、氯化锌反应、氯化锌碘反应、氢碘酸反应与碘液硫酸反应来鉴定木化、木栓化、角质化、纤维素化或半纤维素化的细胞壁；对树脂和挥发油类可选择醋酸铜反应、察列夫斯基反应以及染色法、盐酸升华法和蒸发法等进行鉴定；对淀粉粒、不同的黏液质、糊粉粒、菊糖、鞣质、草酸钙与碳酸钙结晶等采用碘反应、苏丹红与紫草反应、钌红反应、亚甲兰反应、刚果红反应、高铁酸反应、钨酸钠反应、A-萘酚反应、麝香草酚反应、稀醋酸或稀盐酸等反应进行鉴别；对蛋白质用碘反应、三硝基酚反应、硝酸汞反应、硝酸脱黄反应、氯化汞溴酚蓝反应、硫酸铜反应进行鉴别[1，3-4]。

2.2 显微组织化学定位在药用植物研究的应用

有效药用成分的显微组织化学定位的研究，是研究次生代谢产物在植物组织器官分布规律和动态积累过程的重要方法。显微组织化学已在糖类、蛋白质、脂类、树脂和挥发油、分泌物、色素、细胞壁、苷类、鞣质、无机盐等物质的鉴定上日趋完善，并在药用植物的研究中得到成功运用，其中在对植物的次生代谢物进行组织化学定位研究过程中还发现不同植物器官中存在的类型及分布模式具有多样性。

2.2.1 黄酮类化合物研究 葛楚源等[5]研究了黄酮组织化学定位，结果表明黄酮存在于表皮、厚角组织的分泌细胞中，叶中黄酮含量高于茎部。陈婧[6]在蕤核的形态解剖学及组织化学定位研究中发现黄酮多分布于叶片的栅栏组织和厚角组织。康杰芳等[7]通过组织化学定位实验观察，指出萜类和黄酮类化合物主要分布在根的皮层、茎的皮层和韧皮部细胞中。廖云海等[8]应用植物解剖学、组织化学和植物化学方法，对光果甘草各营养器官的结构、总黄酮的组织化学定位和含量差异进行了研究，发现每年可在果熟期和枯萎期之间采挖药材，有效成分含量最高。李娜等[9]应用显微组织化学定位出萜类和黄酮类化合物主要分布在金粟兰根的皮层、茎的皮层及韧皮部细胞中。

2.2.2 皂苷类化合物研究 叶祖云等[10]在太子参微块根发育的解剖学与组织化学定位研究中发现，在成熟的微块根中太子参皂苷主要分布在次生木质部和韧皮部维管薄壁细胞中。林如等[11]通过组织结构研究发现，绞股蓝茎叶内人参皂苷含量较根和根茎高。王桂芹等[12]对白头翁药用部位解剖结构和皂苷组织化学定位进行研究，指出皂苷类物质的形成和贮藏主要与次生韧皮部、分泌腔和分泌道有关。刘世彪等[13]应用组织化学定位技术及植物化学等方法对绞股蓝进行研究，发现了不同发育阶段茎叶的结构与其中人参皂苷分布积累和总皂苷含量具有相关性。谭玲玲等[14]对北柴胡的组织化学定位及其含量比较研究发现，柴胡皂普和黄酮类化合物在根、茎、叶中分布，且发现总黄酮在根、茎、叶中的含量变化规律为叶>茎>根。

2.2.3 生物碱研究 闫晋晋等[20]应用显微组织化学定位观察发现，生物碱主要分布在主根(川乌)次生韧皮部薄壁组织细胞与束间形成层的外侧细胞、不定根(附子)和茎基部的内皮层、韧皮部外侧薄壁细胞中。李玉萍等[21]对蛇根木根部生物碱积累的组织化学定位研究指出，蛇根木种植形成层当年根部就可以产生和积累生物碱。吕洪飞等[22]对不同年龄的石斛及其伪品(小叶石仙桃)的不同器官进行生物碱组织化学定位研究，明确有效部位和最佳采收期。史文静等[23]采用石蜡切片和组织化学的方法对苦豆子营养器官进行研究，指出所测部位均含有生物总碱。

闫晋晋[24]对乌头所形成的附子的形态结构、发育过程、药用成分生物碱分布研究发现，生物碱的分布存在动态积累过程。彭斯文等[25]采用植物组织化学定位的方法大致测定杜鹃兰营养器官中生物碱含量为假鳞茎>叶柄>叶片。刘文哲等[26]在喜树幼枝的喜树碱积累及其组织内定位研究中发现，喜树碱的主要积累部位是幼茎和幼叶内部由1～2层细胞包围而成的分泌道。杜亚填等[27]从红豆杉药用部位的结构及其与多酚类化合物积累研究中发现，南方红豆杉紫杉醇存在于幼茎皮和茎形成层愈伤组织中，曼地亚红豆杉紫杉醇则存在于茎形成层和顶端分生组织的愈伤组织中，且各自含量差别较大。

2.2.4 蒽醌类化合物研究 刘文哲等[28]对大黄蒽醌类化合物组织化学定位研究发现大黄根茎内蒽醌类化合物主要积累在次生木质部的木射线和次生韧皮部的韧皮射线细胞中。王贵智等[29]在唐古特大黄茎蒽醌类化合物组织化学定位研究中发现蒽醌类化合物在唐古特大黄茎中的分布是多位点的，主要分布在表皮、近表皮的皮层细胞、维管束中木质部和韧皮部的薄壁细胞及髓射线细胞中。谭凯丽等[30]应用显微组织化学定位方法发现何首乌中的蒽醌类物质主要存在于块根内。沈宗根等[31]对蒽醌类物质定位研究指出蒽醌类物质在芦荟叶内的贮藏方式是呈多位点的，且贮水组织细胞中不贮存蒽醌类物质。

2.2.5 挥发油研究 穆靖[32]利用石蜡切片技术和苏丹Ⅲ溶液对挥发油进行组织化学定位，发现挥发油主要分布在根茎的皮层、髓及根的皮层中。

2.2.6 其他有效成分研究 殷奎德等[33]在拟南芥叶片超氧自由基的组织化学定位研究中指出，在逆境条件下超氧自由基可能会发生变化。吕洪飞等[34]对元宝草叶的分泌结构与其次生产物研究指出，分泌细胞团分泌的金丝桃素主要分布于海绵组织中，其中分泌小管道分泌的挥发油分布于各器官的韧皮部中，分泌囊分泌的挥发油分布于上下表皮之间或海绵组织和栅栏组织中。包英华等[36]通过实验研究优化了金钗石斛多糖组织化学定位方法，明确金钗石斛多糖主要分布在根的皮层薄壁细胞、茎的维管束周围薄壁细胞内。张莹等[36]指出分泌道是明党参中香豆素积累的主要场所。李鹏等[37]利用石蜡切片法研究紫锥菊药用部位的结构，利用组织化学的方法研究了多酚类化合物的分布。

3 讨论

中药材包含植物、动物、矿物、其他等类型，其中植物药应用广泛，约占中药资源总量的80%。中药的有效成分是药物预防和治愈疾病的基础，而这些有效成分存在中药的组织细胞中，且大多是组织细胞的次生代谢产物。次生代谢产物包含黄酮类化合物、生物碱类化合物、多糖类化合物及油脂类化合物等，药用植物的生理活性水平高低直接关系到中药的品质优劣。因此，应用显微组织化学方法对植物内部组织结构观察，进而对药用部位有效成分进行定位研究，寻找生长环境迫使有效成分动态积累规律，在中药材栽培过程中使有效成分在有效部位大量积累，从而提升中药材的品质，为中药材的开发利用创造有利条件。

随着显微技术发展的逐步成熟，不仅可以用于对固定的死细胞与组织切片显色的静态观察，还能对活的细胞组织中特征性物质进行动态观察。可以把新鲜药用植物有效部位切片假想成一个发生化学反应的“容器”，通过超微管道滴加试剂进行组织间的化学反应，可在细胞组织中直接观察物质发生化学反应的全过程，显微组织化学研究由单纯的形态定位转为结构与功能的结合研究，大大扩充了研究范围，也是显微组织化学定位今后发展的一个新方向。

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TheApplicationofMicroscopicHistochemicalLocalizationinTraditionalChineseMedicineStudy

LINLi1，2*，SHIXiaolong1，GAOSufang1，CHENHonggang1

(1.DepartmentofPharmacy，GansuCollegeofTraditionalChineseMedicne，Lanzhou730000China；2.KeylaboratoryofChemistryandQualityforTraditionalChineseMedicineandTibetMedicineCollegesinGansuProvince，Lanzhou730000，China)

Based on studies of microstructure identification and dynamic histochemical location of Traditional Chinese Medicine，Summarized the frontier of microscopic histochemical，characteristic reaction and microscopic histochemical localization，using of key techniques and high-end instruments，in order to offer methodology and technical guidance for development and utilization of Chinese Medicine Resources，meanwhile，provide new research ideas and methods .Through the collected，analyzed，induced and summed up the relative literatures both at domestic and abroad from Chinese HowNet，Wanfang database and Springer Link electronic journal database.The comprehensive analysis microscopic histochemical localization technology could locate characterized material in Traditional Chinese Medicine，explore the synthesis pathway and metabolic law.The technology had great development potential and provided new scientific basis for quality identification of Traditional Chinese Medicine.

Microscopic，Histochemical localization，Traditional Chinese Medicine

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.06.019

2013-07-29)