新疆维吾尔族宫颈癌组织中C/EBPα第一外显子突变与HPV16感染的关系

龙海晨 ，王红英 ，李玉华 ，杨昕 ，左强强 ，范佩文 ，郭彩丽 ，潘泽民

（1石河子大学医学院生物化学教研室/新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，石河子 832002；2新疆医科大学基础医学院微生物学教研室，乌鲁木齐 830011；3喀什地区第一人民医院病理科，喀什 844000；4新疆医科大学自治区中医医院病理科，乌鲁木齐 830000）

CCAAT增强子结合蛋白 （CCAAT enhancer binding protein，C/EBP）能与启动子的 CCAAT区及多种逆转录病毒增强子序列相结合而得名，人们最早发现的CCAAT增强子结合蛋白是C/EBPα，由Johnson等人[1]于1987年从大鼠肝中分离发现。GT GG（T/A）（T/A）（T/A）G序列是许多病毒共有的核心序列，例如：肝炎病毒（HBV）、鼠肉瘤病毒、猿猴病毒SV-40。另外多种鸟类逆转录病毒的LTR区也拥有该序列，C/EBPα能够与该核心序列结合并且能够抑制 SV40、HBV 基因的转录[2]。 Raught等人[3]发现C/EBPs能下调艾滋病毒HIV-1的启动子的活性。 人乳头瘤病毒（human papilomavirus，HPV）与宫颈癌关系密切，其中HPV16是宫颈癌感染的高危病毒[4]。新疆南部地区维吾尔族宫颈癌中HPV16的感染率较高[5]。课题组在前期研究中发现，新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织中C/EBPα第一外显子存在突变，然而这个突变与新疆维吾尔族宫颈癌高危病毒HPV16的感染是否存在关系还不清楚。本研究采用46例新疆维吾尔族宫颈癌组织进行研究，分析C/EBPα第一外显子突变与HPV16感染的关系，并且对突变与未突变组织中C/EBPα的表达情况进行了比较。

1 资料与方法

1.1 标本的收集

2009年4月至2011年8月收集于喀什地区人民医院，新疆维吾尔自治区人民医院，新疆维吾尔自治区中医院的宫颈癌标本共46例，-80℃冰箱保存。

样本均采集于维吾尔族患者，患者年龄最小为35岁，最大为 68 岁，患者平均年龄（48.60±9.50）岁。年龄无显著性差异。

1.2 主要试剂

DNA提取试剂盒购买于天根公司。RNA逆转录用Thermo逆转录试剂盒。引物设计采用在线Primer3软件，引物由上海生工生物公司合成，稀释成10 pmol/μL使用。检测CEBPα突变引物序列：正 向 引 物 CEBPαF：5’-GCAGGCTGGAGCCCCTGTACGA-3’，反向引物 CEBPαR:5’-CCGGCGACCCCAAACCACTCC-3’。突变检测由上海天昊生物科技有限公司 （Shanghai Genesky Bio-Tech CO.,LTD.）分析。HPV16引物序列：正向引物HPV16 F:5’-GACCCAGAAAGTTACCACAG-3’， 反 向 引 物HPV16 R:5’-CACAACGGTTTGTTGTATTG-3’。RTPCR CEBPα 引物序列： 正向引物 CEBPαF：5’-CACCTGCAGTTCCAGATCG-3’， 反向引物 CEBPαR:5’-CTCGTTGCTGTTCTTGTCCA-3’。 GAPDH引物序列： 正向引物GAPDH F:5’-GCCAAAAGGGTCATCATCTC-3’， 反向引物 GAPDH R:5’-GTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3’。

1.3 PCR检测突变方法

将 DNA 模板 1 μL，MIX12.5 μL, 水 10.5 μL，CEBPα正向引物0.5μL和CEBPα反向引物各0.5 μL加入200 μL的EP管中，PCR反应程序：预变性:95℃，900 s;扩增变性:94℃,15 s，68℃退火延伸60s，循环35次。反应产物片段大小为726 bp，对该片段进行测序。

1.4 PCR检测HPV16方法

将 DNA 模板 1 μL，MIX12.5 μL, 水 10.5 μL，HPV16 正向引物 0.5 μL，HPV16 反向引物 0.5 μL 加入200 μL的EP管中，PCR反应程序：预变性95℃，600 s； 扩增变性：95℃，30 s，55℃退火 90 s，72℃延伸90 s，循环35次；最后72℃延伸600 s。PCR反应产物为268 bp大小片段，用1.5%琼脂糖进行电泳鉴定。

1.5 RT-PCR方法

用Trizol法提取RNA后用逆转录试剂盒逆转录为cDNA，CEBPα基因RT-PCR反应体系：将模板 cDNA1 μL，MIX12.5 μL，水 10.5 μL，CEBPα 正向引物 0.5 μL，CEBPα 反向引物 0.5 μL 加入 200 μL 的 EP 管中。PCR 反应程序：预变性:95°C，900 s；扩增变性：95°C，30 s，48°C 退火 90 s，72℃延伸 90 s，循环35次；最后72℃延伸600 s。PCR反应产物为240 bp大小片段，用1.5%琼脂糖进行电泳鉴定。GAPDH基因RT-PCR反应体系：将模板cDNA 1μL，MIX 12.5 μL, 水 10.5 μL,GAPDH 正向引物0.5 μL，GAPDH 反向引物 0.5 μL， 加入 200 μL 的EP 管中。 PCR 反应程序：预变性：95°C，300 s；扩增变性：95°C，30 s，53°C 退火 45 s，72℃延伸 45 s，循环35次；最后72℃延伸600 s。PCR反应产物为287 bp大小片段，用1.5%琼脂糖进行电泳鉴定。

1.6 统计方法

采用SPSS17.0软件McNemanr法进行检验分析。

2 结果与分析

2.1 新疆维吾尔族宫颈癌组织中C/EBPα基因第一外显子突变情况分析

经过基因测序分析发现新疆维吾尔族宫颈癌组织中C/EBPα第一外显子突变检出率为23.91%（46位新疆维吾尔族宫颈癌患者中有11位存在突变）测序结果（图 1）。

图1 新疆维吾尔族宫颈癌组织中C/EBPα第一外显子突变检测结果Fig.1 The sequencing result of the first exon of C/EBPα mutation in cervical cancer tissues

经过测序发现宫颈癌组织C/EBPα基因外显子1插入acccgc 6个碱基，造成p.His195_Pro196dup（195号组氨酸和196号脯氨酸重复出现）。

2.2 PCR方法分析宫颈癌组织中HPV16的感染

通过分析发现，如果宫颈癌组织中存在HPV16病毒感染，在268bp处有一个扩增带，如果未感染HPV16病毒，则无扩增带（图2）。

图2 HPV16在宫颈癌组织中的PCR检测结果Fig.2 The result of PCR detecting of HPV16 in cervical cancer tissues

2.3 新疆维吾尔族宫颈癌组织中C/EBPα第一外显子突变与HPV16的感染的情况分析

采用SPSS17.0软件McNemanr法进行检验分析后发现，在新疆维吾尔族宫颈癌组织样本中C/EBPα第一外显子突变的组织的HPV16感染率明显高于C/EBPα第一外显子未突变的组织的HPV16感染率。46例样本中HPV16感染率为54.38%，C/EBPα第一外显子突变的组织的HPV16感染率为72.73%，C/EBPα第一外显子未突变的组织的HPV16感染率为48.57%两者具有统计学差异 （P＜0.05）（表 1）。 HPV16 的 PCR 检测结果（图 2）。

表1 宫颈癌组织中C/EBPα第一外显子突变与HPV16感染水平分析Tab.1 The analysis of the first exon of C/EBPα mutation and infection level of HPV16 in cervical cancer tissues

2.3 新疆维吾尔族宫颈癌组织中C/EBPα基因的mRNA表达水平分析

采用RT-PCR方法对11例C/EBPα基因突变的宫颈癌组织和24例C/EBPα基因未突变的宫颈癌组织进行分析，发现4、5、7号C/EBPα基因第一外显子突变的癌组织中C/EBPα基因mRNA的表达量很低；而24例C/EBPα基因未突变的宫颈癌组织中无C/EBPα基因mRNA表达量很低的标本。（图 3，图 4）。

图3 C/EBPα基因突变的宫颈癌组织C/EBPα基因mRNA表达水平Fig.3 C/EBPα gene mRNA expression level in cervical cancer tissues of C/EBPα mutation gene

图4 C/EBPα基因未突变的宫颈癌组织C/EBPα基因mRNA表达水平Fig.4 C/EBPα gene mRNA expression level in cervical cancer tissues of non-mutationgene C/EBPα gene

3 讨论

宫颈癌是妇女生殖系统常见的一种恶性肿瘤，在世界范围内，宫颈癌对广大妇女的生命健康造成了严重危害[6]。我国宫颈癌患病率和病死率都很高，约占世界的三分之一[7]。新疆是全国各省区宫颈癌病死率前六位，唯一处于西北边疆的地区，维吾尔族妇女患病率明显高于汉族与其它民族为459/10万～590/10万，病死率为15.78/10万[8]。C/EBPα基因在白血病、肝癌、前列腺癌、皮肤癌以及脂肪肉瘤等[9-14]多种肿瘤中表现出抑癌基因的特性。HPV16在宫颈癌中属于高危病毒[15]。与HPV16相关的研究推动了宫颈癌防治的发展[16]。本研究发现在新疆维吾尔族妇女宫颈癌患者中，C/EBPα第一外显子突变的患者HPV16病毒的感染率高于C/EBPα第一外显子未突变的患者，两者的差异具有统计学意义。新疆维吾尔族宫颈癌HPV16病毒感染率高，C/EBPα具有抑癌基因的特性，并且能够抑制多种病毒的活性，在C/EBPα第一外显子突变的患者中HPV16病毒的感染率升高，使患宫颈癌的风险加大。C/EBPα第一外显子突变的3例癌组织中C/EBPα基因的mRNA表达水平很低，可能该突变影响基因的表达。另外，C/EBPα第一外显子的195号组氨酸和196号脯氨酸重复出现突变，也可能是导致新疆维吾尔族宫颈癌的一个因素。这为宫颈癌的诊断、治疗提供了一个研究方向。

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