重组人血小板源生长因子的药学研究进展

范宝庆，薛雯，于聪，曹小丹，黄瑞晶，李静，徐立华，张学况，张玲，李剑



重组人血小板源生长因子的药学研究进展

范宝庆，薛雯，于聪，曹小丹，黄瑞晶，李静，徐立华，张学况，张玲，李剑

300452 天津，天士力控股集团研究院生物药品研究所

血小板源生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）是一种通常存贮于血小板 α 颗粒中的碱性蛋白质，由血小板趋化到受损部位的巨噬细胞，受损血管处的平滑肌细胞以及受损部位的血管内皮细胞等多种细胞所分泌。自从发现 PDGF 后，人们已成功地纯化了人、猪、牛、羊等的 PDGF，并对其理化性质进行了大量的研究。PDGF 是一种热稳定的阳离子型糖蛋白，分子量为 28 ~ 35 kD，是由分子量分别为 13 ~ 14 kD 和 16 ~ 17 kD 的两个亚基通过二硫键连接组成。PDGF 的等电点为 9.8 ~ 10.2，具有耐高温（100 ℃）、耐酸（pH 2.5）以及耐受各种解离剂（4 mol/L 盐酸胍、6 mol/L 尿素、2% SDS）的特点。凝胶层析发现，人 PDGF 在体内有两种形式，即 PDGF-I（分子量为 31 kD）和 PDGF-II（分子量为 28 kD），两者在氨基酸及以共价键相连的碳水化合物的组成上有所不同，但其致丝裂活性相似[1]。

PDGF 是由 A、B 两条多肽链通过二硫键连接而成的同型或异型二聚体，包括三种形式：PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB。在人类血小板来源中 85% ~ 90% 的 PDGF 为 AB 型，10% ~ 15% 为 BB 型，A、B 链基因分别位于第 7、22 号染色体，经 2-巯基乙醇还原或胰蛋白酶消化后，分解为两条无活性的亚基，其生物学活性也几乎完全消失，由此证明连接两个亚基的二硫键对保持PDGF 的生物学活性起着十分重要的作用，其空间结构如图 1 所示。

PDGF 的主要生物学特性有：①趋化作用：刺激成纤维细胞、平滑肌细胞、中性粒细胞、单核细胞的趋化迁移，对机体的损伤修复极为重要；②致分裂性：促进多种细胞的 DNA 合成和细胞裂解、增殖；③增加细胞外基质（ECM）的合成积聚：促进多种 ECM 成分如胶原纤维、整合素、纤维连接蛋白（FN）、层黏蛋白（LN）、黏多糖等的合成，抑制 ECM 的降解，参与组织器官纤维化、硬化的发生、发展过程；④血管活性效应：能诱导不同类型血管的收缩[2]。

1 PDGF 的生产工艺研究进展

继PDGF-A 链和PDGF-B 链的氨基酸序列被报道后，关于PDGF 的研究工作迅速开展起来。20 世纪 80 年代初期美国就开始对 PDGF 展开研究，到 80 年代末 90 年代初取得了实质性进展，并申请了大量专利，形成了 PDGF 的核心技术。其中 Chiron 公司研究获得突破，通过重组 DNA 技术，制备了 PDGF-AA，并申请了专利。此外，其他许多公司对该项目也投入了大量研究，其中有关于 PDGF-BB、PDGF-AB 的制备技术和PDGF 药物的作用等研究工作[3]。据统计，美国有关 PDGF 的专利有 46个，主要针对其载体及表达菌株的构建、相关疾病的治疗研究等方面，其中 12 个专利具有很大的研究和借鉴价值。FDA 于 1997 年 12 月 16 日批准了 Ortho-McNeil Pharmaceuticals 和 Johnson & Johnson 公司用于治疗糖尿病神经病理性下肢溃疡的贝卡普勒明凝胶（Becaplermin）（商品名Regranex）的生产[4]。

图 1 PDGF-BB 的蛋白结构

国内多家单位也进行了大量相关的基础性研究，李发武等根据 PDGF-B 链序列设计合成含靶向PDGF 基因 siRNA 转录模板的茎环结构，与两端分别有H I、III酶切位点的 pSilencer3.1-Hlhygro 质粒连接，转化大肠杆菌，扩增、纯化得到所需质粒。通过琼脂糖凝胶电泳及基因测序鉴定其分子量及插入片段的序列。结果表明，PCR 扩增片段与预期结果相符，双酶切证实 PDGF siRNA 表达载体克隆构建成功[5-6]。杨春露等[7]利用RT-PCR从人血管内皮细胞总RNA 中扩增出PDGF-B 的 cDNA，然后克隆至酵母表达质粒 pMETB 和 pMETαA，从而获得了含信号肽（578 bp）和不含信号肽（340 bp）的编码 PDGF-B 链基因，构建了 PDGF-B 的酵母表达载体 pMETB-PDGFB1、pMETαA-PDGFB2。陈建庭等[8]用基因重组技术构建 pQE-PDGF-B 原核表达载体，在 M15 大肠杆菌中进行 PDGF-B 单体蛋白的表达。结果经酶切鉴定、PCR 鉴定及基因测序证明，pQE30 载体上成功地插入了PDGF-B 成熟肽基因。薛亮等[9]建立了重组人血小板源生长因子-BB（rhPDGF-BB）在酿酒酵母中的表达及纯化工艺。在 5 L 发酵罐中，探讨接种量、溶氧、诱导温度和诱导 pH 值对菌体密度及目的蛋白表达量的影响，并通过离子交换层析和凝胶过滤层析对目的蛋白进行纯化。经 84 h 发酵，细胞600值可达 65.1，目的蛋白表达量占 26%。纯化后的蛋白纯度可达 95%，产量为 15.4 mg/L，收率为 21.9%，为其大规模生产奠定了基础。董荣娜等[10]通过脂质体瞬间转染的方法将含有rhPDGF-BB 全长的质粒转染CHO 细胞系，稳定表达 rhPDGF-BB 的 CHO 细胞具有新的生物学功能，实现了组织工程种子细胞的构建，为研究糖尿病溃疡创面愈合的生物材料提供实验基础。任雨笙等[11]采用超声裂解、酸醇抽提、离子交换色谱、凝胶色谱等方法提纯 PDGF，用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其相对分子质量，并检测其生物学活性，建立简单有效的猪PDGF 纯化方法，纯化的 PDGF相对分子质量为（2.879 ~ 3.078）× 104，活性回收率为 3%，比活性为 3.41176 × 105U/mg，为进一步研究PDGF 的理化性质及生物学特性打下基础。高凯等[12]建立了重组人血小板源生长因子（rhPDGF-BB）的质控方法和质量标准，具有保证产品安全、有效、质量可控的特点，可用于重组人血小板源生长因子产品的常规检定。

北京金赛狮生物制药技术开发有限责任公司成功建立了生产rhPDGF-BB的方法，将 PDGF-B 基因正确置于酵母表达载体 pPICZ-αA，转化酵母菌株 SMD1168H，经筛选建立分泌表达 rhPDGF-BB 的工程菌株，经过两级种子培养，上罐发酵，纯化，从而获得了rhPDGF-BB 重组蛋白。天士力控股集团研究院从北京金赛狮生物制药技术有限公司引进 rhPDGF-BB 项目，并进一步推进其药学研究，包括发酵工艺优化放大研究，最佳培养基配方筛选、优化 pH、温度、发酵时间、氧载体等发酵工艺参数，确定最佳发酵工艺路线，使表达量达到 40 mg/L，为大规模发酵奠定基础；同时进行了纯化工艺的优化放大研究，利用正交实验和析因实验研究最佳上样量、流速、pH 和电导等参数，确定最佳的工艺路线，使收率和产量比转让工艺有大幅度提高，为大规模纯化奠定基础；制剂工艺学研究，采用先进的生物活性凝胶制剂作为药物剂型，深入研究如何大规模制备稳定的 rhPDGF-BB 水凝胶制剂，在此基础上已经成功进行了临床I、II 以及 III 期用药的生产工作。

2 PDGF 的制剂制备研究进展

卓冰[13]报道了新的重组血小板源生长因子的水凝胶制剂制备方法。该水凝胶制剂含有：药物成分rhPDGF-BB、水凝胶基质、稳定剂、等渗剂和 pH 调节剂。其中水凝胶基质主要外用于治疗糖尿病患者的溃疡伤口，特点在于：在湿润的环境下，有利于伤口的愈合；基质本身具有弹性和柔软性，同时外观透明；透过凝胶持续缓慢释放药物，维持药效作用时间。经过试验和筛选，选择了新型辅料卡波姆。卡波姆是一种聚丙烯酸交联树脂，在很低的浓度下即可形成较高黏度的凝胶[14-16]。可用于制备水凝胶的卡波姆型号较多，主要有两类。其中Carbomer 1940 分子链较短、黏度高、吸附能力强，药物释放缓慢。用其作为基质时药物释放缓慢、持久。经试验表明，当其浓度为 0.4% 时具有很好的稳定性和药效。而 Carbomer 1981 类分子链长、黏度低。当它作为 PDGF 药物基质时，该凝胶皮肤吸附力强，较快发挥药效。另外，选择氨基酸作为稳定剂，0.9% 氯化钠、5% 葡萄糖和 3% 甘露醇作为等渗剂，10% NaOH 作为 pH 调节剂，在药剂学中常用的防腐剂中优选 0.8% 的尼泊金乙酯，另加入金属络合剂 0.3% 的 EDTA-Na 起到稳定作用。FDA 批准的 rhPDGF-BB 在中国知识产权局申请的专利 96198773.1 中，其权利要求保护的是 PDGF 的凝胶制剂，该凝胶制剂凝胶基质为纤维素聚合物，及可药用的带电荷化学物质，包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸、鱼精蛋白、丙氨酸等与锌、镁的组合[17-18]。

3 PDGF 的药理毒理学研究进展

戴礼苹等[19]以链脲霉素（streptozocin，STZ）所致糖尿病小鼠（STZ 小鼠）以及非肥胖型糖尿病（non-obese diabetes，Nod）小鼠（Nod 小鼠）为模型，制作全厚度皮肤切口，用 rhPDGF 对其连续治疗 5 d，观察皮肤创口愈合情况，结果 rhPDGF 能明显促进糖尿病小鼠皮肤创口的愈合，10 μg/cm2即有明显促进糖尿病小鼠皮肤创口愈合的作用。孙同柱等[20]将 26 只糖尿病大鼠在背部两侧各制备 2 个全层皮肤缺损创面，随机分成五组进行实验，结果显示 rhPDGF-BB 对糖尿病大鼠全层皮肤缺损创面有明显促修复作用，表现在促进创面肉芽组织生长、毛细血管胚芽形成与再上皮化。rhPDGF-BB 的三种不同剂量中，以中剂量（7.0 μg/cm2）组表现出促创面修复作用最为明显。钟建莉等[21]探讨了 rhPDGF-BB 对大鼠正畸牙移动过程中破骨细胞 FAK 表达的影响，发现 rhPDGF-BB 作为局部调节因子促进了正畸牙移动骨改建过程。在大鼠正畸牙压力侧牙槽骨改建的过程中，FAK 参与了整合素 α_vβ_3 在破骨细胞信号转导的下游通路，其表达能被外源性的 rhPDGF-BB 所调节。陈强等[22]以切除小白鼠背部皮肤制作创伤模型，人造皮肤覆盖伤口，并在人造皮肤下注射牛PDGF 2 pg/d，共注射 3 d，于注射完毕后第 3、7、10 天对伤口新生上皮肉芽组织生长情况进行观察，结果表明，牛 PDGF 能促进肉芽组织生长上皮再生，使伤口加速愈合，提示牛 PDGF 可应用于临床创伤治疗[22-25]。

4 PDGF 的临床药物的进展

Becaplermin 是目前唯一一个被 FDA 批准治疗糖尿病足溃疡的生长因子药物[26-30]。除此之外，Chiron 和Johnson & Johnson 研制的 rhPDGF-BB 针对压迫性溃疡和静脉性溃疡已经进入临床 III 期试验。国内多家科研单位也进行了该项工艺的研发，但是没有获得实质性的突破，且研究大多处于基础研究阶段。天士力控股集团研究院自接手rhPDGF-BB 项目后，继续推进 PDGF-BB 药学及其临床研究，现已成功完成此项目的基础研究，并采用严格的随机盲法对照方案，对试验药品的有效性和安全性作出初步评价，在此基础上完成了 I、II 期临床研究，并已经启动了 III 期临床试验。在I 期临床中，考察了单剂量和多剂量外用 rhPDGF-BB 凝胶剂在中国健康受试者中的耐受性特征，制剂规格为 5 g，每克含 rhPDGF-BB 0.1 mg 或 10 000 单位，中国健康受试者单剂量外用 0.25 ~ 4 g 和多剂量外用 0.5 ~ 2 g 的 rhPDGF-BB 凝胶剂是安全的，能够很好耐受，为该药临床应用的安全、合理使用提供依据。II 期临床采用随机、双盲、多中心、安慰剂平行对照评价 rhPDGF-BB 不同剂量治疗慢性糖尿病足溃疡 II 期的临床效果。其安全性良好，不良反应轻微，治疗 20 周内高剂量组（100 μg/g）目标溃疡完全愈合率优于低剂量组（30 μg/g）和对照组，推荐采用高剂量组（100 μg/g）进行 III 期临床试验，进一步确认其治疗慢性糖尿病皮肤溃疡的有效性和安全性[31-32]。目前 III 期临床试验正在进行中。

rhPDGF-BB 经过十多年时间的市场应用，其安全性和有效性在临床上得到了充分证明；rhPDGF-BB 尤其对病理性深度溃疡的伤口增殖修复、促进皮肤血管的再生有明显疗效。国际市场上销售的 Becaplermin（含 0.01% rhPDGF-BB），每支售价为 275 英镑/15 g，天士力预计售价为 150 元人民币，价格优势明显，竞争力强。此外，rhPDGF-BB 目前大量用于高档生物化妆品和大规模细胞培养，因此也可以出口 rhPDGF-BB 原料药，扩大产品市场。天士力开发的制剂产品具有显著的成本优势，具备同国际上同类产品竞争的实力，可以拓展国际市场，出口创汇，创造更大的经济和社会效益。

5 结语

随着对 PDGF 基础研究的深入，rhPDGF 表达的各种不同的工程菌被构建，发酵和纯化等路线的进一步优化，PDGF 的产业化会很快实现，对于它的药理与毒理学的认识也会进一步加深，rhPDGF-BB 作为临床用药，在治疗一些慢性难愈合性伤口如糖尿病溃疡、慢性静脉性溃疡、褥疮、放射性溃疡等方面已经取得了非常不错的疗效，并且将被进一步用于佐剂、蛋白载体、生物材料等多个方面，估计在不久的将来，rhPDGF 会在医学、生物学等各方面发挥更重要的作用。

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李剑，Email：lijian16@tasly.com.cn

2013-11-07

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.06.009