HER2在病理性瘢痕组织中的蛋白表达、基因扩增及其临床意义

肖明明， 侯 慧， 任秋华， 高 爽， 景士兵， 杜振广

实验研究

HER2在病理性瘢痕组织中的蛋白表达、基因扩增及其临床意义

肖明明， 侯 慧， 任秋华， 高 爽， 景士兵， 杜振广

目的探讨人类表皮生长因子受体2(HER2)在正常皮肤组织、成熟性瘢痕及病理性瘢痕中的表达及其临床意义。方法采用免疫荧光原位杂交和组织芯片免疫组化学链菌素亲生物素-过氧化酶连接法，检测正常皮肤10例、成熟瘢痕16例、增生性瘢痕9例和瘢痕疙瘩40例中HER2蛋白表达及基因扩增情况。结果正常皮肤、成熟瘢痕、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩中，HER2蛋白阳性表达率分别为0、25.00%、66.67%、85.00%；基因扩增阳性率分别为0、12.50%、55.56%、80.00%。病理性瘢痕中HER2蛋白表达水平、基因扩增阳性率均较高，与正常皮肤、成熟性瘢痕比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论HER2在病理性瘢痕中表达增强，提示HER2可能参与了病理性瘢痕的形成，故针对HER2靶向治疗瘢痕，有一定的临床应用前景。

人类表皮生长因子受体2； 瘢痕； 免疫荧光； 免疫组织化学

人体皮肤创伤后发生瘢痕修复，当瘢痕形成超过正常限度时，称为病理性瘢痕。临床最常见的病理性瘢痕包括增生性瘢痕(hypertrophic scar, HS)和瘢痕疙瘩(keloid)[1]。病理性瘢痕不仅严重影响美观，而且后期易发生挛缩，导致组织或器官移位变形，因此，预防及治疗病理性瘢痕的临床意义重大[2]。笔者采用荧光原位杂交技术(fluorescent in situ hybridization,FISH)和组织芯片免疫组化链菌素亲生物素-过氧化酶连接法(streptavidin peroxidase conjugated method,SP)在基因及蛋白水平检测正常皮肤、成熟瘢痕、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2, HER2)蛋白表达及基因扩增情况，探讨其与病理性瘢痕形成的关系，以期为病理性瘢痕的临床治疗提供新的思路。

1 对象与方法

1.1 标本来源

标本取自2005年1月至2013年6月在辽宁省人民医院手术切除存档的石蜡包埋组织，共75例。其中瘢痕疙瘩40例，增生性瘢痕9例，正常皮肤10例(取自病理性瘢痕周围的正常皮肤或植皮患者取皮区正常皮肤)，成熟瘢痕16例(在手术或外伤1年后，瘢痕色泽变淡，外形平整，光镜下胶原纤维平行排列)。所有患者术前均未做化学治疗及放射治疗，1年内无注射药物及外用药物史。将蜡块切5 μm切片1张，经苏木精-伊红(hematoxylin-eosinstaining, HE)染色后，在蜡块上选取相应区域，采用手工组织芯片制备仪(上海博南生物技术有限公司)，制备组织标本直径为2 mm的组织芯片，从芯片蜡块上切5 μm切片3张，分别用于HE染色、FISH及SP法分析。

1.2 主要试剂和方法

1.2.1 组织芯片蜡块制备 将受体蜡块放在37 ℃恒温台上，软化5 min；固定蜡块，利用2 mm点样针，在受体蜡块上打孔，针点间隔1 mm，受体蜡块按10×6阵列打孔；打孔完成后，使用点样针在预先做好取样标记的供体蜡块上取样；将点样针取出的样本，填入受体蜡块的蜡孔中；组织芯片蜡块面朝下，放在一玻片上轻拍，使组织芯片蜡块表面整齐；将组织芯片蜡块放在65 ℃烤箱中30 min，使其完全熔合；将自然冷却的组织芯片蜡块放在冷冻台上5 min，制备完毕。

1.2.2 免疫组织化学SP法 主要试剂：鼠抗人HER2单克隆抗体(克隆系CB11)、即用型SP免疫组织化学染色试剂盒(北京中杉金桥生物科技有限公司)。组织芯片蜡块切片脱蜡后至水；蒸馏水冲洗， 磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)浸5 min；3%H2O2室温孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性；PBS液冲洗3次，每次2 min；滴加稀释的HER2抗体(1∶100)，37 ℃孵育2 h；PBS液冲洗3次，每次2 min；滴加试剂1(二氨基联苯胺底物浓缩液),37 ℃孵育20 min，PBS液冲洗3次，每次2 min；滴加试剂2(二氨基联苯胺底物缓冲液)，37 ℃孵育20 min，PBS液冲洗3次，每次2 min；显色剂显色；自来水充分冲洗，复染，脱水透明，封片。用PBS代替HER2抗体作为阴性对照，阳性对照为已知的HER2阳性乳腺癌组织切片。

1.2.3 FISH 主要试剂：GLP HER2/CSP 17探针和蛋白酶K(北京金菩嘉公司)。将组织切片65 ℃下烘烤3 min；将组织切片浸于二甲苯中室温脱蜡2次，每次10 min，随后浸入100%乙醇中5 min；室温下，将组织切片依次置于100%、85%和70%乙醇中各2 min复水。组织切片室温浸入去离子水中3 min，用无绒纸巾吸取多余的水分。100 ℃沸水煮玻片20 min，浓度为100 μg/ml的蛋白酶K中消化；将组织切片置于核酸杂交漂洗液中漂洗5 min,漂洗2次。1%甲醛室温固定10 min。玻片依次置于-20 ℃预冷的70%、85%和100%乙醇中各2 min脱水；将组织切片室温浸入丙酮溶液中2 min。自然干燥玻片。加热玻片至56℃。将10 μl探针混合物滴加于玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，用橡皮胶封片，准备杂交仪器。共变性条件：83 ℃ 5 min，42 ℃ 16 h。玻片洗涤：0.3%乙基苯基聚乙二醇 65 ℃冲洗1.5 min, 0.1%乙基苯基聚乙二醇室温冲洗30 s,70%乙醇冲洗3 min。暗处自然干燥玻片；室温中将15 μl 4,6-二氨基-2-苯基吲哚复染剂滴加于玻片杂交区域，立即盖上盖玻片。暗处放置10～20 min，在Olympus BX51型荧光显微镜下，选用合适的滤片组观察玻片。杂交成功的判断标准为多于75%的细胞核内有2个或2个以上HER2信号。

1.3 结果判定标准

免疫组织化学结果判定标准：显微镜下观察细胞质或细胞膜呈棕黄色，判定为阳性细胞，以阳性细胞为基础，结合细胞的染色强度来判定抗原的表达强度。阳性细胞的比例<10%为阴性，10%～30%为弱阳性，>30%为强阳性；荧光原位杂交结果判定标准：计数30个细胞，统计Ratio值(Ratio值=30个细胞核中红信号总数/30个细胞核中绿信号总数)。Ratio<1.8为阴性结果，提示该样本无HER2基因扩增；Ratio>2.2为阳性结果，提示样本中HER2基因发生扩增；Ratio在1.8～2.2时，可增加计数细胞至100个,或重做FISH实验来判断最终结果。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0软件统计数据，样本大于40时，采用χ2检验；样本小于40时，采用确切概率法；P<0.05时，差异有统计学意义。

2 结果

2.1 瘢痕组织及正常皮肤组织中HER2的蛋白表达

HER2蛋白定位于细胞膜及细胞浆，表达于表皮、真皮乳头层及网状层的部分成纤维细胞和血管内皮细胞中。10例正常皮肤组织未见着色；成熟瘢痕4例阳性，阳性率为25%；增生性瘢痕6例阳性，阳性率为66.67%；瘢痕疙瘩34例阳性，阳性率为85%。HER2蛋白在增生性瘢痕及瘢痕疙瘩的阳性表达率，较正常皮肤及成熟瘢痕高，差异有统计学意义(P<0.05)。增生性瘢痕与瘢痕疙瘩相比，HER2的蛋白阳性表达率差异无统计学意义(P>0.05)，见表1和图1，2。

2.2 瘢痕组织及正常皮肤组织中HER2的基因扩增

10例正常皮肤组织中，均无HER2基因扩增，成熟瘢痕有2例HER2基因扩增,阳性率为12.50%；增生性瘢痕有5例基因扩增，阳性率为55.56%；瘢痕疙瘩有32例基因扩增，阳性率为80.00%。HER2基因在增生性瘢痕及瘢痕疙瘩的扩增阳性率，较正常皮肤及成熟瘢痕高，差异有统计学意义(P<0.05)。增生性瘢痕与瘢痕疙瘩相比，HER2的基因扩增阳性率，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1和图3。

3 讨论

表1 瘢痕组织及正常皮肤组织中HER2的蛋白表达及基因扩增

注：a,b与正常皮肤和成熟瘢痕比较,差异有统计学意义，P<0.05

定位于人染色体17q12-21.23的HER2基因，编码一种跨膜酪氨酸激酶受体，该受体蛋白与HER家族成员及其配体之间相互作用，通过细胞间信号传导来调节细胞生长、生存、分化和增殖[3]。研究表明，HER2在多种肿瘤中过度表达，并且与肿瘤的发生、发展和预后密切相关[4-8]。Finigan等[9]报道，去整合素金属蛋白酶17-神经调节蛋白-1-人类表皮生长因子受体2(ADAM17-NRG-1-HER2)通路，在白介素1β(interleukin-1，IL-1β)介导的急性肺损伤中起着重要作用，且在其他哮喘及囊性纤维化中也发挥重要作用。HER2的激活，使得肺泡及气管上皮屏障功能损伤并出现肺水肿。Faress等[10]报道，在肺损伤的患者中，阻断HER2基因，发现肺纤维程度减弱，胶原沉积少，并提高肺损伤患者的存活率。

本研究结果表明，在病理性瘢痕组织中HER2表达增高。Gu等[11]报道，在大鼠皮肤溃疡创面愈合中，HER2在修复早期成纤维细胞、新生毛细血管及表皮细胞中表达阳性，在成熟瘢痕形成后，很快转阴。而本研究结果显示，人在创伤且病理性愈合后，HER2表达未转阴，反而表达更高，提示HER2基因可能对病理性瘢痕的形成起重要作用。HER2对于病理性瘢痕形成的机制，可能是通过磷脂酰肌醇-3-激酶-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(PI3K-Akt)通路来调节细胞分裂、分化和增殖。因此，HER2很可能通过PI3K-Akt 途径促进病理性瘢痕形成[12]。

本研究提示，HER2与病理性瘢痕的形成密切相关。目前，一些药物能干扰HER2表达，如赫赛汀在乳腺癌治疗中的应用，已成为靶向治疗的成功范例[13]。对HER2的表达或者功能进行干预，是否能对病理性瘢痕起到治疗作用，尚值得探讨。

图1 组织芯片免疫组织化学切片图2 组织芯片免疫组织化学SP法检测HER2蛋白表达情况 a.正常皮肤组织HER2蛋白阴性表达(×200) b.病理性瘢痕表皮HER2蛋白阳性表达(×200) c.病理性瘢痕真皮HER2蛋白阳性表达(×200 )图3 FISH方法检测HER2基因扩增情况 a.正常皮肤组织HER2基因无扩增 b.病理性瘢痕HER2基因扩增

Fig1 Tissue microarray immunohistochemisry sections.Fig2 Detection of the HER2 protein expression by tissue microarray immunohistochemistry SP method. a. Expression of HER2 protein was negative in normal skin tissues (×200 ). b. the positive expression of HER2 protein in pathological scar epidermis (×200 ). c. the positive expression of HER2 protein in pathological scar dermal (×200 ).Fig3 Detection of the amplification of HER2 gene by FISH method. a. normal skin tissue without HER2 gene amplification. b. amplification of HER2 gene in pathological scar.

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ExpressionofHER2protein,geneamplificationanditsclinicalsignificanceinpathologicalscar

XIAOMing-ming,HOUHui,RENQiu-hua,etal.
(DepartmentofPathology,People′sHospitalofLiaoningProvince,Shenyang110016,China)

ObjectiveTo explore the expression of HER2 in normal skin tissue, mature scar pathological scar and its clinical significance.MethodsImmune fluorescence in situ hybridization and tissue microarray immunohistochemical SP method were adopted to detecte HER2 protein expression and gene amplification in 10 cases of normal skin, 16 cases of mature scar, 9 cases of hyperplastic scar and 40 cases of keloid.ResultsThe positive expression of HER2 proteins in normal skin, mature scar, hyperplastic scar and keloid were 0, 25.00%, 66.67%, 85.00%, respectively; The positive rates of HER2 gene amplification in normal skin, mature scar, hyperplastic scar and keloid were 0, 12.50%, 55.56%, 80.00%, respectively. Comparing with normal skin and mature scar, the expression level of HER2 protein and gene amplification in pathological scar was higher (P<0.05).ConclusionEnhanced expression of HER2 in pathological scar, suggesting that HER2 may be involved in the formation of pathological scar, so HER2 targeted treatment of scar has certain prospect of clinical application.

Human epidermal growth factor receptor-2； Scar； Immunofluorescence； Immunohistochemistry

R619.6

A

1673-7040(2014)02-0122-04

2013-11-02)

110016 辽宁 沈阳，辽宁省人民医院(病理科：肖明明，侯 慧，任秋华，高 爽，景士兵；骨肿瘤科：杜振广)

肖明明(1978-)，女，内蒙古牙克石人，主治医师，硕士研究生.

景士兵，110016，辽宁省人民医院 病理科，电子信箱：mypathology@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.02.020