D 980 nm激光对大鼠皮肤的组织学改变及收缩效果影响的实验研究

倪金影， 张 威， 孙世杰， 马英君

激光治疗

D 980 nm激光对大鼠皮肤的组织学改变及收缩效果影响的实验研究

倪金影， 张 威， 孙世杰， 马英君

目的通过观察D 980 nm激光在连续模式和脉冲模式下，不同光纤移动速度和不同脉冲宽度对大鼠皮肤的胶原纤维、弹力纤维以及皮肤中Ⅰ型胶原蛋白表达的影响，评价D 980 nm激光对皮肤的作用。方法选取36只SD大鼠，平均分为6组，其中3组采用连续模式，3组采用脉冲模式，进行皮下照射。激光能量密度为25 J/cm2、功率为5 W。连续模式组的光纤移动速度分别为0.2、0.5、1.0 cm/s；脉冲模式组的脉冲宽度分别为10、20、30 ms(间歇期为10 ms，移动速度为0.5 cm/s),术后3个月切取各实验组的大鼠背部皮肤进行检测。结果通过对大鼠的HE染色、弹力纤维染色、Ⅰ型胶原蛋白的免疫组化染色可知，D 980 nm激光光纤移动速度为0.5 cm/s，脉冲宽度为20 ms，皮肤的改善效果较佳。相同作用条件下，脉冲模式优于连续模式。结论①不同移动速度和脉冲宽度均能达到改善皮肤质量的目的。②连续模式速度为0.5 cm/s时，脉冲模式脉冲宽度为20 ms时,皮肤的改善效果较佳。③相同条件下，激光脉冲模式优于连续模式，并可见明显差异。

D 980 nm激光; Ⅰ型胶原蛋白; 光纤速度; 脉冲宽度

容貌的改变是目前最关注的话题之一。容貌改变的最根本原因是面部皮肤的老化,因此，如何改善皮肤质量使其看起来更加年轻，是人们一直关注的焦点，近30年出现了很多改善皮肤老化的新技术[1-2]，但激光作为一种新兴的非手术整形美容治疗方法似乎更能够迎合现今忙碌的人群。实验中发现，无论是D 980 nm激光，点阵激光还是强脉冲光均可以达到改善皮肤质量和增加皮肤中胶原蛋白的目的[3-6]。1994年，G Apfelberg等着力研究将光纤插入到直径为1 mm的套管后引导激光与皮下组织直接接触，使光纤的作用位置更加准确。研究还发现，激光不仅能使脂肪溶解，并有其他有益的作用[7]。自2012年12月至2013年8月，笔者参考此方法，对D 980 nm激光对大鼠皮肤的组织学改变以及收缩效果的影响进行了研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物 随机选取佳木斯大学动物实验中心的36只清洁级SD大鼠。雌雄各18只,体质量250～300 g，月龄12～24个月。室温20 ℃～25 ℃下，正常分笼饲养。

1.2 实验仪器 D 980激光治疗仪(CERAMOPTEC GMBH公司, 德国)，波长为980 nm。操作模式为连续/脉冲模式，输出功率以及脉冲宽度均可调节。

1.3实验方法 将大鼠平均分为6组，3组采取连续模式，3组采用脉冲模式，进行皮下照射。用10%水合氯醛300 mg/kg进行腹腔麻醉，将大鼠背部脊柱两侧面积为5.0 cm×3.0 cm的区域分别进行脱毛处理，局部碘伏消毒。肿胀麻醉液(0.9%氯化钠注射液1000 ml+2%利多卡因注射液25 ml+1:1000肾上腺素注射液1 ml+8.4%碳酸氢钠注射液12.5 ml)在标记区行局部浸润麻醉，调节激光器的作用参数，能量密度为25 J/cm2,功率恒定为5 W，光纤平行作用间距为1.0 cm。当光纤皮下作用速度不同时，激光选择连续作用模式，3组速度分别为0.2,0.5和1.0 cm/s；当光纤以不同的脉冲宽度作用时，激光选择脉冲作用模式，3组脉冲宽度分别为10,20和30 ms(间歇期为10 ms，移动速度为0.5 cm/s)。光纤放置在套管内，将套管通过皮肤小插口插入到组织后发射激光，缓慢而均匀地移动光纤套管，相同的参数下不同移动速度和脉冲宽度作用于各个实验组，术中使用红外测温仪监测体表温度(需<42 ℃)，术后背部皮肤涂冷凝胶并密切观察。

1.4 标本制备及保存 术后3个月，切取大鼠背部两侧尽可能新鲜的皮肤组织，取小于0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm组织块，PBS冲洗，4%多聚甲醛液中浸泡固定，石蜡包埋，切片。进行HE染色、弹力纤维染色和Ⅰ型胶原蛋白免疫组化染色。

1.5 Ⅰ型胶原蛋白免疫组化图像半定量分析 参照免疫组化试剂盒的操作方法进行免疫组化染色，图像采用Image-Pro Plus 6.0美国版进行Ⅰ型胶原蛋白阳性表达的测量，每张片子随机选取5个视野，计算出平均每个视野中Ⅰ型胶原蛋白的阳性率，评分系统=A×B(A为阳性率，B为阳性强度)，计算出每个视野中Ⅰ型胶原蛋白的相对量。

2 结果

2.1 HE染色及弹力纤维染色 真皮明显增厚，胶原纤维显著增加、增粗，纤维排列致密，染色较深，脂肪细胞减少，小血管密集，弹力纤维增多增粗，走行更有序，皮肤表面无任何损伤。

2.2 免疫组织化学染色 Ⅰ型胶原蛋白染色位于细胞外，呈棕黄色为阳性。用病理图文系统对免疫组化切片结果进行分析，连续模式3组中，速度为0.5 cm/s组与速度为0.2 cm/s组比较，Ⅰ型胶原蛋白的表达明显增多(P<0.01)；速度为0.5 cm/s组与1.0 cm/s组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图1,表1。脉冲模式3组中，脉冲宽度为20 ms与脉冲宽度10 ms组和30 ms组比较，Ⅰ型胶原蛋白表达明显增强(P<0.01，P<0.001)，见图2，表2。当连续模式与脉冲模式在相同条件下作用时，两者差异具有统计学意义(P<0.05，表3)。

3 讨论

人随着年龄的增长，面部肌肤将会渐渐地失去原有的青春光泽与活力，取而代之的是干燥、色斑、皱纹、皮肤松弛、毛细血管扩张甚至是皮肤肿瘤[8]。选择性光热原理(theory of selective photothermolysis)使得激光与组织的相互作用有了一个较为完整的理解，推动激光在医学领域的应用。激光作为一种新兴的非手术治疗方法，主要是作用于皮损部位后，通过光的选择性吸收效应和生物刺激作用，使真皮胶原纤维被加热，出现收缩变性，并诱发真皮内的创伤愈合反应产生的胶原蛋白有序的沉积，从而提高皮肤弹性并减少皱纹。最初的剥脱性激光由于治疗过程中不仅汽化了部分的真皮和全部的表皮层，而且术后出现一系列的并发症。近年来，通过技术不断的提高，现在取得了很好的进展[9]。随后的非剥脱性激光采用了表面冷却装置，但缺乏真正的创面愈合反应，而使术后的效果不够明显[10]。为了克服传统激光治疗的不足，出现了两种激光的有效结合，即点阵式激光疗法，其改善眶周皱纹效果显著，无不良反应发生[11]。Q开关Nd:YAG激光能够保证表皮角质层的完整并取得了一定的成果[12]。

胶原蛋白占人体全身总蛋白的30%以上，女性的胶原蛋白充足皮肤会细致光滑且皱纹少[13]。皮肤老化的基本组织学改变是胶原蛋白的流失，真皮胶原纤维、弹力纤维等有型成分和组织间质减少，正是因为胶原蛋白和水分的流失，造成皮肤塌陷，支撑皮肤的胶原肽键和弹力网断裂，其螺旋网状结构被破坏，肌肤出现干燥、皱纹、松弛无弹性等衰老现象。所以，要延缓衰老必须要补充胶原蛋白。虽然注射胶原能够在一定程度上改善皮肤结构[14]，但无论是口服还是注射真正能被人体吸收的胶原都是微量的，而且维持的时间较短[15],达不到更好更快的治疗效果。

图1 3个月后3组连续模式中Ⅰ型胶原蛋白的表达(SP ×400) a.移动速度0.2 cm/s b.移动速度0.5 cm/s c.移动速度1.0 cm/s图2 3个月后3组脉冲模式中Ⅰ型胶原蛋白的表达(SP ×400) a.脉冲宽度10 ms b.脉冲宽度20 ms c.脉冲宽度30 ms

Fig1 Expression of Ⅰ type collagen at 3 months in the continuous mode groups (SP ×400). a. 0.2 cm/s translational speed. b. 0.5 cm/s translational speed. c. 1.0 cm/s translational speed.Fig2 Expression of Ⅰ type collagen at 3 months in the pulse mode groups (SP ×400).a. 10 ms pulse width. b. 20 ms pulse width. c. 30 ms pulse width.

表1 3组连续模式中Ⅰ型胶原蛋白的表达

移动速度(cm/s)Ⅰ型胶原蛋白阳性值0.20.58±0.170.51.04±0.21a1.00.98±0.31b

注：a表示0.2 cm/s与0.5 cm/s相比,P<0.01;b表示0.5 cm/s 与1.0 cm/s相比，P>0.05

表2 3组脉冲模式中Ⅰ型胶原蛋白的表达

脉冲宽度/msⅠ型胶原蛋白阳性值100.61±0.31201.41±0.26a300.58±0.21b

注：a表示10 ms与20 ms相比,P<0.01;b表示20 ms与30 ms相比,P<0.001

表3 连续模式组和脉冲模式组中Ⅰ型胶原蛋白的表达

操作模式Ⅰ型胶原蛋白阳性值 连续模式(0.5cm/s)1.04±0.21 脉冲模式/20ms1.41±0.26a

注：a表示连续模式与脉冲模式相比,P<0.05

本研究所使用的D 980 nm激光不同于传统的激光疗法，其特有的波长能够不伤害表皮层，可直接插入作用于皮肤真皮层，通过光热效应加热靶组织，使激光的作用位置更加准确。既然加热皮肤即可增加皮肤有型成分的含量，那么我们只要选择不破坏表皮，而直接加热真皮的激光就可以达到“嫩肤”的目的。大量的实验证明，真皮组织被加热后，可直接或通过一系列相关的细胞因子使胶原细胞产生新的胶原，并通过直接汽化或改变代谢的方法去除皮肤表面的色素性损伤。激光治疗已能在术后达到很好的效果，最重要的是激光可以刺激结缔组织中的胶原蛋白与弹力纤维的数量与走行，使组织重新粘连，达到皮肤收缩的效果。激光辅助下的皮肤溶脂与紧缩在临床上的效果明显，其在治疗上更侧重于激光治疗后胶原蛋白与弹性纤维的改变对皮肤紧缩程度的影响，而不是大量的吸出脂肪组织，同时能够刺激胶原纤维和弹力纤维的增多，且术后的并发症较少。本研究证实，术后3个月皮肤达到了结构重塑的作用，胶原纤维、弹力纤维排列的更加紧密。

本实验通过对组织学和Ⅰ型胶原蛋白的免疫组织化观察发现，当激光选择连续作用模式速度为0.5 cm/s时,效果较好；当激光选择脉冲作用模式，脉冲宽度设定为20 ms时，可达到较佳的改善皮肤效果。总之，激光在面部的皮肤年轻化方面有着广阔的应用前景，新型激光器的应用使治疗效果和安全性得到了一定程度的兼顾，其他激光治疗在国内开展的时间还不长，还存在不少有待进一步探讨的问题，如适应证的选择，疗程的设置以及疗效的客观判定标准等，尤其是更适合中国人肤质的治疗参数。

通过本实验观察到，D 980 nm激光具有促进大鼠皮肤胶原纤维、弹力纤维和Ⅰ型胶原蛋白含量增加的功效，为D 980 nm在临床上进行皮肤质量改善方面的临床应用和进一步研究提供了更好的理论依据，同时观察到不同的光纤皮下移动速度和不同的脉冲宽度中，0.5 cm/s和20 ms具有更好的刺激真皮层中Ⅰ型胶原蛋白合成的作用，当连续模式与脉冲模式在相同条件下作用时，后者效果明显优于前者。以上可以作为今后临床应用中的参考参数。

[1] 马 琼, 段静娴, 孙索姣, 等. 强脉冲光联合Q开关532 nm激光治疗面部皮肤光老化疗效观察[J]. 中国美容医学, 2011,20(11):1768-1770.

[2] 邹 菥, 何 黎. 面部皮肤老化的治疗[J]. 临床皮肤科杂志, 2012,41(2):124-126.

[3] 许 蕾, 张 威, 吕 岩. 德国D980半导体激光仪溶脂紧肤的动物实验研究[J]. 中国美容整形外科杂志, 2013,24(4):243-245.

[4] 蔡金辉, 陈 葵, 翁伟丽, 等. 点阵铒激光治疗面部皮肤老化[J]. 中国激光医学杂志, 2011,20(2):112-115.

[5] 葛明盖, 党永岩, 顾 军. 强脉冲光照射对皮肤结构和胶原蛋白表达影响实验研究[J]. 应用激光, 2012,32(3):261-264.

[6] 陈 朗, 金 岚, 周国富. 不同参数超声波对大鼠皮肤胶原蛋白含量的影响及比较[J]. 中国超声医学杂志, 2011,27(5):396-398.

[7] 潘福强, 黎 冻, 周 翔, 等. 长脉冲Nd:YAG激光“点阵式”治疗面部血管瘤疗效观察[J]. 中国美容医学, 2012,21(5):799-801.

[8] Peterson JD, Goldman MP. Rejuvenation of the aging chest: a review and our experience[J]. Dermatol Surg, 2011,37(5): 555-571.

[9] Berlin AL, Hussain M, Phelps R, et al. A prospective study of fractional scanned nonsequential carbon dioxide laser resurfacing：a clinical and histopathologic evaluation[J]. Dermatol Surg, 2009,35(2):222-228.

[10] LI YH, WU Y, CHEN JZ, et al. A split-face study of intense pulsed light on photoaging skin in Chinese population[J]. Lasers Surg Med, 2010,42(2):185-191.

[11] 马 刚, 林晓曦, 胡晓洁, 等. CO2点阵激光治疗眶周皱纹的临床观察[J]. 中国美容整形外科杂志, 2010,21(3):170-172.

[12] Cohen SR, Henssler C, Johnston J. Fractional photothermolysis for skin rejuvenation[J]. Plast Reconstr Surg, 2009,124(1):281-290.

[13] 王佳曼. 胶原及其产物在皮肤老化及皮肤修复中的应用[J]. 中国美容医学, 2012,21(1):176-178.

[14] Rzany B, Hilton S, Prager W, et al. Expert guideline on the use of porcine collagen in aesthetic medicine [J]. J Dtsch Dermatol Ges, 2010,8(3):210-217.

[15] Flynn TC. Botulinum toxin: examining duration of effect in facial aesthetic applications[J]. Am J Clin Dermatol, 2010,11(3):183-199.

EffectsofD980nmlaseronhistologicalchangesandcontractionofratskin

NIJin-ying,ZHANGWei,SUNShi-jie,etal.

(DepartmentofMaxillofacialSurgery,StomatologyCollegeofJiamusiUniversity,Jiamusi154002,China)

ObjectiveTo evaluate the effects of D 980 nm with different movement speed and pulse width on the collagen fibers, elastic fibers and expression of Ⅰ type collagen under continuous and pusle mode.MethodsThirty-six SD rats were divided randomly into 6 groups, three were treated with subcutaneous irradiation under continuous mode, the other three were adopted with that under pulse mode. The laser energy density was 25 J/cm2and power was 5 W. The translational speed of optical fiber in the continuous mode groups were 0.2, 0.5 and 1.0 cm/s, pulse width were 10, 20 and 30 ms in the pulse mode groups with 10 ms intermission and 0.5 cm/s translational speed. The samples harvested from the dorsal skin of each group at 3 months were detected.ResultsD 980 nm laser at 0.5 cm/s translational speed and 20 ms pulse width could obtain the best effect on refirming. In the same conditions, the pulse mode surpassed the continuous mode.Conclusion①Different speed and pulse width can achieve the purpose of improving the quality of the skin. ②Under the same parameters, D 980 nm laser at 0.5 cm/s translational speed and 20 mspulse width could obtain the best effect on refirming. ③In the same conditions, the pulse mode surpassed the continuous mode with obvious difference.

D 980 nm Laser; Ⅰ type collagen; Optical fiber speed; Pulse width

154002 黑龙江 佳木斯，佳木斯大学附属第二医院 颌面外科

倪金影(1988-)，女，黑龙江人，硕士研究生.

张 威，154002，佳木斯大学附属第二医院 颌面外科，电子信箱：kinwai01@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.07.006

R454.2

A

1673-7040(2014)07-0399-04

2014-05-10)