TOLL样受体2及4在脊柱关节炎患者外周血CD14+单核细胞表面的表达及意义

王卫远等

[摘要] 目的 观察脊柱关节炎（SpA）患者外周血CD14+单核细胞Toll样受体2（TLR2）和Toll样受体4（TLR4）的表达变化及其与临床指标的关系，探讨其在SpA的发病中的作用。 方法 选择2008年7月～2009年1月蚌埠医学院第一附属医院风湿免疫科确诊SpA患者71例，并选择30名健康体检者作为正常对照组。采用流式细胞术检测外周血CD14+单核细胞表面TLR2、TLR4阳性细胞的表达的百分率及平均荧光强度（MFI）。根据BASDAI评分将SpA患者组分为活动组54例（BASDAI评分>4分）和非活动组17例（BASDAI评分≤4分），分别比较活动组、非活动组和正常对照组三组间TLR2、TLR4阳性细胞表达百分率和MFI的差异，并分析TLR2、TLR4阳性细胞表达百分率和MFI与相关临床和实验室指标的相关性。 结果 TLR2+外周血CD14+单核细胞的表面表达百分率在活动组、非活动组及正常对照组间差异无统计学意义（均P > 0.05）。TLR2+外周血CD14+单核细胞表面MFI在各组间差异无统计学意义（均P > 0.05）。TLR4+外周血CD14+单核细胞的表面表达的百分率在活动组和非活动组[（42.5±11.1）%、（32.9±9.4）%]与正常组相比[（22.3±7.5）%]，差异有高度统计学意义（P < 0.01），活动组和非活动组之间相比差异有高度统计学意义（P < 0.01）。TLR4+外周血CD14+单核细胞的MFI在各组间比较差异无统计学意义（均P > 0.05）。TLR4+外周血CD14+单核细胞的表面表达的百分率与ESR和IgA呈正相关（P < 0.05），TLR2+外周血CD14+单核细胞的表面表达的百分率与ESR和IgG呈正相关（P < 0.05）。 结论 TLR4在SpA患者外周血CD14+单核细胞表面表达有显著性变化，提示TLR4可能与SpA发生及病情存在一定的关联，TLR4和TLR2的表达可作为疾病活动度的参考指标。

[关键词] Toll样受体；脊柱关节炎；单核细胞；流式细胞术

[中图分类号] R593.23 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）09（a）-0062-05

[Abstract] Objective To investigate the effect and possible mechanism of Toll-like receptor-2 （TLR2） and Toll-like receptor-4 （TLR4） in the development and progress of spondyloarthropathy. Methods 71 SpA patients in the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College from July 2008 to January 2009 were selected， and 26 cases of healthy controls were selected. SpA patients of 54 cases and 17 cases were divided into the active stage group and stable stage group， according to BASDAI score. Flow cytometry analysis was used to detect the expression of CD14+ monocyte surface TLR2/4 positive cells， the TLR2 and TLR4 expression rate， the mean fluorenscence intensity （MFI） and the related clinical and laboratory indicators. Results There was no significant differences in the expression rate and MFI of TLR2 on CD14+ monocyte in the peripheral blood of SpA patients among the active stage group， stable stage group and healthy control group （P > 0.05）. The expression rates of TLR4 in the CD14+ monocytes were [（42.5±11.1）%] and [（32.9±9.4） %] respectively in the active stage group and stable stage group， both were higher than that of control group[（22.3±7.5） %]， there were significant differences among the three groups （P < 0.01）， there was also significant difference between the active stage group and stable stage group （P < 0.01）. There was no significant differences in MFI of TLR4 on CD14+ monocyte in the peripheral blood of SpA patients among the active stage group， stable stage group and healthy control group （P > 0.05）. The expressiong rate of TLR4+ correlated positively with ESR and IgA （P < 0.05）， the expressiong rate of TLR2+ correlated positively with ESR and IgG （P < 0.05）. Conclusion The expression pattern of TLR4 on CD14+ peripheral blood monocyte cells surface in SpA patients has significant changes. The results indicate that TLR4 play an important role in immune reaction of SpA. The expression of TLR2 and TLR4 in peripheral blood monocytes may help in assessing disease activity in SpA patients.endprint

[Key words] Toll like receptor； Spondyloarthropathy； Mononcyter； Flow cytometry

脊柱关节炎（spondyloarthropathy，SpA）是一组具有共同特征的相互关联的侵犯脊柱、外周关节和关节周围组织的多系统炎性疾病的总称，严重者可发生脊柱畸形和关节强直，其病因至今尚不明确。有研究表明，感染可能是其发病因素之一。目前普遍认为，微生物可能通过感染宿主使其产生免疫应答促使SpA发病。Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）作为一种模式识别受体，在抗感染与免疫信号的转导过程中起重要作用，TLRs激活后引发细胞的信号转导最终导致炎性介质的释放，启动炎症和适应性免疫应答。目前的研究认为，TLRs在多种免疫介导性疾病中发挥了重要作用，SpA也是一种免疫性疾病，但目前有关TLRs与SpA的研究甚少[1]。本研究采用流式细胞术测定了SpA患者CD14+单核细胞表面TLR2和TLR4表达的百分率及平均荧光强度（mean fluorescence intension，MFI），并与正常对照进行比较。同时，分析SpA患者CD14+单核细胞表面TLR2和TLR4表达的百分率与有关临床和实验室指标的相关性，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2008年7月～2009年1月蚌埠医学院第一附属医院风湿免疫科确诊的SpA患者71例，SpA患者诊断均符合1991年ESSC制订的SpA分类标准[2]，其中，强直性脊柱炎、银屑病关节炎、反应性关节炎、幼年脊柱关节炎、未分化脊柱关节炎又符合各自诊断标准，均有CT证实的骶髂关节炎。排除严重肝炎、肿瘤和其他自身免疫病患者，且3个月内未使用激素、免疫抑制剂和生物制剂。所有患者中男61例，女10例；年龄12～54岁，平均（27±10）岁；其中，强直性脊柱炎49例，反应性关节炎4例，幼年脊柱关节炎8例，银屑病关节炎2例，未分化脊柱关节炎8例。所有SpA患者参照BASDAI评分评定病情活动，分为活动组54例（BASDAI评分>4分）和非活动组17例（BASDAI评分≤4分）。选择蚌埠医学院第一附属医院健康志愿者30名作为正常对照，其中，男26例，女4例，年龄18～41岁，平均（26±6）岁，均无SpA既往史和家族史，排除其他自身免疫性疾病和感染性疾病表现。各组间性别和年龄等一般情况比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。

1.2 试剂与仪器

荧光素FITC小鼠抗人CD14单抗（克隆号H1221购自天津协和干细胞基因工程有限公司），TLR2-PE（克隆号TL2.1，购自Ebioscience公司），TLR2-PE（克隆号TTA123，购自Ebioscience公司），流式细胞仪（美国B-D公司FACS Calibur），氯化氨溶血剂和PBS洗液为蚌埠医学院免疫学实验室自行配制。

1.3 方法

1.3.1 流式细胞染色 抽取患者和正常人肘静脉血2 mL于抗凝管中，每份标本分装5管，从第2管开始，依次加入CD14-FITC 4 μL、TLR2-PE 4 μL 或TLR4-PE 4 μL于管底，用鼠IgG2a抗体作为同型对照；然后加30 μL的抗凝全血混匀，置室温避光孵育20 min，加入3 mL/管氯化氨溶血剂，充分混匀后室温避光15 min，以破坏红细胞。将试管置于离心机，以1500 r/min离心5 min，吸去上清液；2 mL/管PBS液（pH 7.2）洗涤2次，1500 r/min离心5 min，吸去上清液。加入PBS液（pH 7.2）300 μL，流式细胞术检测。同样处理的细胞设置未加荧光抗体对照管，用小鼠Ig2a-PE作表面染色的同型对照管，仅做表面染色抗人CD14-FITC单色荧光抗体染色作为调试流式细胞仪荧光补偿管。

1.3.2 流式细胞术检测细胞表面受体数据获取及分析 在流式细胞仪上用Cellquest软件检测待测样品，利用未染色管和单荧光抗体染色管设置光电倍增管（PMT）电压和荧光补偿，利用同型对照管区分是否有非特异性染色，利用未染色管和同型对照管设置阴阳界限，然后对待测样品进行检测。每管测定获取105个细胞的数据。在利用Cellquest软件分析结果时，首先在前向散射光（forward light scatter，FSC）和侧向散射光（side light scatter，SSC）点阵图上划定单核细胞区域R1（region 1），然后在FL-1（CD14+-FITC）和FL-2（TLR2-PE或TLR4-PE）点阵图上设定CD14阳性细胞群为R2，通过设门G2 =R1*R2选择双阳性单核细胞。选择FL-2为X轴，G2为门的直方图，分析TLR2和TLR4的表达百分率及MFI。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验；相关分析采用Pearson相关分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组CD14+单核细胞表面TLR2/4的表达水平比较

2.1.1 TLR2、TLR4在SpA外周血CD14+单核细胞表面阳性率比较 TLR2在SpA活动组、非活动组外周血CD14+单核细胞表面阳性率与正常组相比，差异无统计学意义（P > 0.05），活动组与非活动组相比差异无统计学意义（P > 0.05）。TLR4在SpA活动组、非活动组外周血CD14+单核细胞表面阳性率与正常组相比，差异有高度统计学意义（P < 0.01），活动组与非活动组相比差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1。endprint

3 讨论

SpA最典型的疾病是强直性脊柱炎，还包括反应性关节炎、银屑病关节炎、炎性肠病关节炎、幼年脊柱关节炎及未分化脊柱关节炎，起病隐匿，致残率高。目前研究认为，SpA是一种与HLA-B27不同程度相关、细菌感染诱发及机体免疫异常等多因素参与的自身免疫性疾病[3]。尽管SpA发病中触发感染的证据甚少，但天然免疫应答和获得性免疫应答在脊柱关节炎的形成中均起作用[4]。TLRs是近年来发现的机体感知微生物病原体病激活细胞直接产生免疫的天然免疫受体，TLR可以防止细菌感染宿主，但当不适当的分泌，它能导致慢性炎症和自身免疫性疾病。它的发现使人们重新审视了天然免疫在SpA发生机制中的作用。

TLRs是进化高度保守的Ⅰ型跨膜蛋白，目前在人类已有13种TLR（TLR1～TLR13）被鉴定出[5]TLR1、2、3、4、5和6表达在细胞表面膜，7、8和9存在于细胞内的膜内。TLR2、TLR4是研究最广的受体，前者主要表达在单核细胞及树突细胞上，识别G+菌的肽聚糖；后者表达于单核细胞、巨噬细胞、上皮细胞和内皮细胞，识别G-菌细胞壁的主要成分脂多糖，在天然免疫中，CD14与TLR2/TLR4作为免疫受体，它通过相互间协同作用不但可以识别病原体所特有的病原相关分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs），而且还可特异性识别特定内源性损伤相关分子模式（danger associated molecular patterns，DAMPs）。主要通过MyD88依赖和MyD88非依赖两条途径[6-7]：MyD88依赖途径是目前研究较为清楚的，TLR2/4通过该途径尚需MAL协助MyD88募集下游IL-1受体相关激酶家族（IL-1 receptor-associated kinase family，IRAK）两个成员：IRAK-4和IRAK-1，相继磷酸化，活化后的IRAK-1与MyD88解离，进入胞浆募集可溶性TRAF6（TNFR-associated factor 6），TRAF6在泛素偶联激酶（ubiqiuitin-conjugating enzyme）作用下形成复合物，该复合物可以激活TAK1激酶，活化的TAK1激酶通过激活IKK复合物活化转录因子NF-κB和（或）AP-1，引发促炎细胞因子基因的转录和表达，释放细胞因子如IL-1、IL-6和TNF-α等。简言之，相互识别后通过耦联信号传导途径，激活天然免疫细胞，最终引起一系列的炎性反应，而且其为激活获得性免疫提供共刺激信号。因此，TLR是连接天然免疫与获得性免疫的危险信号受体，可以通过TLR引发免疫应答，参与某些免疫性疾病的发生、发展[8-9]。

Wright等[10]运用蛋白组学方法比较强直性脊柱炎（AS）患者和类风湿关节炎（RA）患者与正常人外周血单核细胞蛋白的表达组成差异，结果显示在AS和RA患者中迁移的单核细胞、TLRs信号传导等与正常人显著不同。最近，Assassi等[11]展示了使用全血基因表达分析表明，TLR4和5的表达显著增加，但不是在健康对照组或系统性红斑狼疮患者。印证了单核细胞的TLRs信号通路在SpA的发病中扮有重要角色。De Rycke等[12]和Yang等[13]已证明TLR2和TLR4在SpA患者血清中、外周血单个核细胞或滑膜组织显著升高，而且其疾病的活动性与TLR4的上调有关，当这些患者应用抗TNF-α阻滞剂治疗，TLR2、TLR4显著降低，这一现象表明免疫细胞内存在多层次不同靶点的负向调控，可以对TLR4所介导的信号通路的开启和传导起到精确的负调控作用，从而抑制TLR4信号转导[14]。虽然入选的患者无一例应用生物制剂治疗，但TLR4的上调仍提示它可能参与SPA的病理过程。

本研究采用流式细胞术检测71例脊柱关节炎患者外周血CD14+单核细胞上TLR2和TLR4的表达，结果显示，脊柱关节炎患者外周血和TLR4在CD14+单核细胞阳性率高于健康对照组，且活动期TLR4表达强于静止期患者。这种高表达可能与其接受感染因子刺激有关，进一步证明感染作为诱因参与SpA的发病，TLR4的高表达也初步提示TLR4及其介导的天然免疫应答与SpA发生发展存在一定相关性。而非活动期患者TLR4的表达虽然低于活动期，但也明显高于健康对照组，推测其不仅参与了SpA的起病阶段，而且在脊柱关节炎后期病情进展中也有重要作用。提示TLR4信号通路参与SpA的发病，活化的单核细胞迁移至病变的关节内，转化成巨噬细胞，通过TLR识别关节内的PAMP，活化JNK、p38和NF-κB信号传导通路，启动机体的炎性反应，并活化获得性免疫系统，合成和释放许多炎症因子，后者除了聚集在关节滑膜上外，还会激活体内配体产生免疫应答，最终导致关节组织和骨组织的破坏[15]。导致SpA炎性反应慢性持续发展。

本研究显示，TLR2的表达在SpA患者组和正常对照组相比无显著性差异。然而，Candia等[16]观察TLR2和TLR4受体在PsA患者单核细胞来源的抗原提呈细胞的表达发现，来自于PsA患者未成熟树突状细胞TLR2表达升高，而成熟树突状细胞和单核细胞与正常对照和类风湿关节炎患者相比无显著性差异。TLR4在任何类型细胞中的表达无明显差异，上清液中细胞因子测定显示为Th1型，多数表达IL-2、TNF-α及IFN-γ，Western blot分析同样证实TLR2表达增加，上调的TLR2为天然免疫在PsA中发病机制提供了支持依据。Florence等[17]研究TLR2和TLR4基因多态性在沙门肠道杆菌引发的ReA中发现，与正常人比较TLR4的变异体无显著性差异，而TLR2（753Q）变异个体易进展为关节炎并具有关节外表现，而TLR2的另外一变异体（631H）男性感染的关节外表现相关。最近报道由Myles等[18]发现经LPS刺激后在肌腱端炎相关的幼年慢性关节炎中发现TLR2和TLR4在外周血和滑夜中单核细胞表达水平增高，并且与健康对照组相比产生较多的IL-6和MMP-3。上述文献支持单核细胞通过TLR2信号转导路径参与SpA的发病，与本实验结果不符，分析原因可能与本次入组的银屑病关节炎及反应性关节炎、幼年脊柱关节炎患者偏少相关，增加样本量及更进一步的分组分层比较也许可以得到相同的结果。人们通过小鼠关节炎模型发现，在类风湿关节炎起始阶段通过TLR2活化促进血管的发生[19]，便于炎症细胞的黏附和侵袭，导致关节软骨和骨组织的破坏，在后期TLR4增加金属蛋白酶介导的破坏作用和破骨细胞形成[20]，导致慢性破坏性关节炎[21]。TLR2与TLR4在类风湿关节炎病情进展过程中的相互转换可能是其中原因之一，是否能够在脊柱关节炎中得到合理解释尚需更多试验佐证。endprint

ESR和血浆CRP是反映各种炎症活动的急性时相反应物，临床研究者把ESR和CRP作为判断治疗后SpA患者病情是否稳定的实验室指标之一。TLR4+和TLR2+细胞的比例均与ESR呈正相关，这提示TLR4和TLR2表达与SpA病情活动具有相关性。同时，TLR2+细胞比例与血清IgG定量呈正相关，TLR4+细胞的表达与血清IgA定量呈正相关，表明SpA患者存在体液免疫亢进和急性炎症或组织损伤。因此，TLR2和TLR4表达水平可能作为评论SpA患者病情的生物学标志，阻断这种结合可能减轻患者的临床症状，但还有很多潜在的机制未能了解和发现，尚需要更深入的研究和发现。

综上所述，临床上观察单核细胞表面TLR2和TLR4的变化可以从一个新的角度客观地反映机体的免疫状态，机体激活TLR4受体的表达，产生天然免疫和炎性反应，启动特异性免疫应答，参与SpA的发病。

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（收稿日期：2014-05-23 本文编辑：程 铭）endprint

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