桑叶对肿瘤血管生成的影响

王志雄等

[摘要] 目的 研究桑叶对肿瘤血管生成中血管内皮细胞增殖、迁移和管腔形成的影响。 方法 用CCK-8试剂盒测定HUVEC-2C细胞数量的变化；用Transwell转移小室研究HUVEC-2C细胞迁移情况；用包被Matrigel的24孔板来培养HUVEC-2C细胞观察其管腔形成情况。实验分为实验组和对照组，每组分别设置3个复孔，在实验组中加入桑叶浸出液。观察桑叶对肿瘤血管生成的影响。 结果 桑叶液可抑制HUVEC-2C细胞的增殖能力，抑制作用随着浓度的增长而增强。在浓度为100、50、25 mg/mL时，与对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。当浓度为100 mg/mL的桑叶液时细胞增殖抑制率可达到37.6%。通过观察Transwell小室，与对照组比较，添加了桑叶液的HUVEC-2C细胞，其迁移能力受到一定的制约作用。Matrigel实验中，与未加入桑叶液的HUVEC-2C细胞所形成的较完整的环状结构比较，加入桑叶液的HUVEC-2C细胞在管腔形成方面受到明显的抑制作用。 结论 桑叶液通过抑制血管内皮细胞增殖、迁移和管腔形成，对肿瘤血管的生成具有抑制作用。

[关键词] 桑叶；肿瘤血管；内皮细胞；增殖；迁移；管腔形成

[中图分类号] R282.71 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）09（a）-0022-04

[Abstract] Objective To study the influence of mulberry on vascular endothelial cell proliferation and migration as well as lumen forming in tumor angiogenesis. Methods The change of HUVEC-2C cell quantity was measured with CCK-8 kit； HUVEC-2C cell migration was studied in Transwell chamber； HUVEC-2C cells were cultured in a 24-pore plate coated with Matrigel to observe its lumen forming. The experiment consisted of experiment group and control group， with three complex holes set for each group. Mulberry leachate was added to the experiment group. The effect of mulberry leaf to tumor angiogenesis was observed. Results Mulberry leachate could inhibit the proliferation ability of HUVEC-2C cell， with the inhibiting effect strengthened as the concentration increases. When the concentration was 100， 50， 25 mg/mL， the difference between the experiment group and the control group had statistical significance （P < 0.05）. When the concentration was 100 mg/mL， the cell proliferation inhibiting ratio of mulberry leachate could reach 37.6%. Observation on Transwell chamber showed the follows： added with mulberry leachate， the HUVEC-2C cells′migration ability was inhibited to some extent compared with the control group. In Matrigel experiment， compared with the comparatively complete cyclic structure formed by HUVEC-2C cells without mulberry leachate， the HUVEC-2C cells added with mulberry leachate were obviously inhibited in term of lumen forming. Conclusion Mulberry leachate has inhibiting effect on tumor angiogenesis by inhibiting vascular endothelial cell proliferation and migration as well as lumen forming.

[Key words] Mulberry leaf； Tumor angiogenesis； Endothelial cells； Proliferation； Migration； Lumen formation

1971年，Folkman[1]首次提出血管生成与肿瘤生长之间的关系问题。随后许多研究陆续证明，肿瘤形成初期，肿瘤细胞能够通过弥散方式获取营养物质。但长到一定大小后，必须从最近的血管处诱导形成自身血管。如果没有血管生成这一过程，肿瘤就会因得不到足够的营养和氧气而进入休眠阶段，甚至坏死[1]。血管为肿瘤生长提供营养和氧气，也是其排泄的通道，更是转移的必要条件[2]。这就为治疗肿瘤提供了一个新思路——通过阻断肿瘤血管的生长，切断肿瘤营养与氧气的供应，从而抑制肿瘤的发生和发展。肿瘤血管与正常血管存在很大差异，但无论是肿瘤血管还是正常的血管，血管内皮细胞（endothelial cell）都是血管的主要组成部分，衬贴于血管内壁。

目前，市场上销售的血管生成抑制药物大都成本高昂，作用途径比较单一，治疗不够彻底，副作用仍然较大，在实际应用中存在一些问题。近年来，随着人民生活水平的提高，饮食结构发生了显著变化，世界各地相关学者专家都在极力寻求天然、安全、保健性食品药品的开发，这种回归自然的愿望已成为走向21世纪的趋势。探寻引起不良反应小的植物成分药已成为血管生成抑制剂发展的重要方向[3]。特别是低价易得植物材料，不但可以解决恶性肿瘤早期防治问题，同时也可充分降低治疗成本，给更多癌症患者提供更大的生存机会。

桑叶，作为古老的中药，其味甘、性平、寒，具有清肝明目聪耳，镇静神经，润肺热，止咳的作用。近年来，有关学者致力于对天然、安全、保健性药食品的开发，通过对桑叶化学成分及生理功能的研究，发现其含有的黄酮类、生物碱等生物活性成分，具有降血糖、降血压、降血脂、抗炎、抗衰老等功效，还能预防肿瘤细胞的生成[4-8]，被国家卫生和计划生育委员会列为药食两用植物。特别是类黄酮中的槲皮素能够抑制多种肿瘤细胞的分裂增殖，通过多种途径促进其凋亡，抑制肿瘤细胞迁移及侵袭，降低其耐药性等作用[9-13]。笔者从血管生成抑制方面来研究桑叶中有效成分对肿瘤生长的影响。

本课题通过探讨低价易得植物材料桑叶中的有效成分对肿瘤血管内皮细胞增殖、迁移以及管腔形成的作用，来探索其对肿瘤血管生成的抑制作用，判断桑叶有效成分抑制肿瘤血管生成的可行性，从而为肿瘤早期预防和治疗提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

桑叶（日本株式会社黑姬和汉药研究所）；HUVEC-2C（Cascade biologics公司，批号C-003-2C）；PBS（pH为7.4，实验室配制）；DMEM高糖培养基（Biowest公司提供）；细胞消化液（Trypsin 0.25%-EDTA 0.02%，Biowest公司提供）；胎牛血清（South America Origin，Biowest公司提供）；双抗（青霉素-链霉素，碧云天生物研究所提供）；CCK-8（上海博谷公司）；Matrigel（威格拉斯生物公司提供）。

1.2 实验设备

超净工作台（SW-CJ-1B，苏州安泰）；电子天平（FA2104，上海舜宇恒平）；二氧化碳培养箱（CP-ST100A，长沙长锦科技）；超声处理仪（JY92-ⅡDN，宁波新芝生物科技股份有限公司）；旋转蒸发器（RE-52CS，上海雅荣生公司）；酶标仪（DNM-9602G北京普朗公司）；倒置生物显微镜（LWD200-37T，上海测维光电）等。镊子；手套；无菌针管；0.22 μm针头过滤器；2 mL PE试管；50 mL离心管；烧杯；量筒；双蒸水；培养皿；离心管；25 mL细胞培养瓶（Corning）；96孔细胞培养板（Corning）；3 mL巴氏吸管（Corning）；Transwell转移小室（Corning）；血球计数器。

1.3 方法

1.3.1 桑叶有效成分的提取[14-15] 精确称取桑叶粉3.00 g，浸泡于60 mL 75%的乙醇中。在50℃、20～25 kHz超声频率下超声30 min后过滤，并将滤渣用60 mL 75%的乙醇再次超声30 min。将得到的两次滤液合并超声混匀，再用0.45 μm的滤纸过滤。滤液用旋转蒸发器在0.08 mPa、60℃的环境下蒸发2.5 h以去除乙醇，得到的溶液定容至30 mL。之后使用0.22 μm的一次性针头过滤器过滤除菌，最终得到的桑叶液浓度为100 mg/mL，依次两倍梯度稀释至50、25、12.5 mg/mL。

1.3.2 细胞培养 实验中HUVEC-2C用配制好的DMEM高糖培养基（含10%胎牛血清，1%双抗）进行培养，用含0.25%胰蛋白酶（0.02% EDTA）消化传代。二氧化碳培养箱环境设置为5%CO2，37℃。

1.3.3 增殖实验 取对数生长期HUVEC-2C，进行消化、计数，控制细胞数量至5×104个/mL。在96孔板中设实验组（100、50、25、12.5 mg/mL）、阳性对照组、阴性对照组，每组设3个复孔，在实验组和阳性对照组中分别加入每孔100 μL的细胞悬液，阴性对照组加入100 μL培养基。在96板内培养HUVEC-2C 8 h直至细胞完全贴壁。在实验组中分别加入10 μL不同浓度桑叶制备液（100、50、25、12.5 mg/mL），阳性对照组、阴性对照组加入10 μL无血清的培养基。培养24 h之后将96孔板置于倒置显微镜下观察，发现细胞无异常生长情况，再在每孔中加入10 μL CCK-8检测试剂，1 h后用酶标仪在单波长450 nm处检测OD值。OD值与细胞密度成正比，OD值越大说明细胞密度越大，反之则越小。

1.3.4 迁移实验 取对数生长期HUVEC-2C，进行消化、重悬后计数，调整细胞数量至1×106/mL。在Transwell转移小室的上室每孔加入200 μL细胞悬液，下室加600 μL无血清DMEM培养基。细胞培养8 h后，在实验组的下室加100 μL浓度为100 mg/mL的桑叶浸出液，对照组加100 μL无血清DMEM培养基，每组设3个复孔。将Transwell转移小室置于5%CO2，37℃二氧化碳培养箱中培养8 h后，用PBS清洗小室内侧，棉球擦去上室内侧中的细胞。小室外侧细胞用无水酒精固定30 min，结晶紫染色30 min。洗净后置于倒置生物显微镜下观察、拍照并分析。

1.3.5 管腔形成实验 用每孔100 μL的Matrigel包被24孔板，室温下放置30 min使Matrigel凝固。取出对数生长期的HUVEC-2C，消化、重悬后计数，调整细胞数量至5×105/mL。实验组和对照组每孔接种500 μL细胞悬液。此外，对照组不加桑叶浸出液，实验组加50 μL浓度为100 mg/mL的桑叶浸出液，每组设置3个复孔。将24孔板放入5%CO2，37℃培养箱中培养，8 h后置于倒置生物显微镜下观察，随机选3个视野拍照。

1.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。其中细胞增殖的抑制率（%）=1-实验组/对照组×100%。

2 结果

3 讨论

正常环境下，血管生成是一个高度有序的过程，只有生长组织有所需求时，才会诱导单层静态内皮细胞分化及血管网络伸展。而肿瘤细胞可以通过模拟正常血管生成过程形成自身血供。肿瘤血管生成主要是通过分泌促血管生长因子，诱导内皮细胞异常增殖、迁移和形成管腔[16]。

桑叶液具有抑制内皮细胞系增殖的能力，抑制作用随着浓度的增长而增强。通过观察Transwell小室，与对照组相比添加了桑叶液的内皮细胞系，其迁移能力受到一定的制约作用。Matrigel实验中，与未加入桑叶液的内皮细胞系所形成的较完整的环状结构相比，加入桑叶液的内皮细胞系在管腔形成方面受到明显的抑制作用。实验表明，桑叶液通过抑制血管内皮细胞增殖、迁移和管腔形成，对肿瘤血管的生成具有抑制作用，从而为其制约肿瘤血管生成、切断营养与氧气供给和废弃物排泄通道、促使肿瘤细胞凋亡提供有力佐证。本研究为桑叶在肿瘤早期预防和治疗中的应用提供了实验依据，使肿瘤早期防治和低成本治疗成为可能。

关于本研究只进行了大量的定性实验，得出桑叶具有抑制血管生成的功效，具体程度尚不明确，且桑叶中的有效组分未知，在之后的研究中将就以上两个方面进一步给予探讨。

[参考文献]

[1] Folkman J. Tumor angiogenesis： therapeutic implications [J]. The New England Journal of Medicine，1971，285（21）：1182-1186.

[2] Kerbel RS. Tumor angiogenesis：past， present and the near future [J]. Carconogenesis，2000，（21）：505.

[3] 徐韬，许瑞安.中药及其有效成分抗肿瘤作用机制研究进展[J].华侨大学学报，2009，30，（4）：359-365.

[4] 张举，肖更生，聊森泰，等.桑叶综合利用进展[J].广东蚕业，2003，4（1）：38-41.

[5] 王芳，励建荣.桑叶的化学成分、生理功能及应用研究进展[J].食品科学，2005，26（1）：111-116.

[6] 欧阳臻，陈钧.桑叶的化学成分及其药理作用研究进展[J].江苏大学学报：自然科学版，2003，24（6）：39-43.

[7] 何雪梅，廖森泰，刘吉平.桑叶的营养功能性成分及药理作用研究进展[J].蚕业科学，2004，30（4）：390-393.

[8] 张春丽.中药对肿瘤血管生成抑制作用的研究[J].北京中医药，2011，30（2）：156-160.

[9] Wachter J，Neureiter D，Alinger B，et al. Influence of five potential anticancer drugs on wnt pathway and cell survival in human biliary tract cancer cells [J]. Int J Bid Sci，2012，8（1）：15-29.

[10] Qin Y，He LY，Chen Y，et al. Quercetin affects leptin and its receptor in human gastric cancer MGC-803 cells and JAKSTAT pathway [J]. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi，2012，28（1）：12-16.

[11] Senthilkumar K，Arunkumar R，Elumalai P，et al. Quercetin inhibits invasion，migration and signalling molecules involved in cell survival and proliferation of prostate cancer cell line （PC-3） [J]. Cell Biochem Funct，2011，29（2）：87-95.

[12] Borska S，Chmielewska M，Wysocka T，et al. In vitro effect of quercetin on human gastric carcinoma：Targeting cancer cells death and MDR [J]. Food Chem Toxicol，2012，50（9）：3375-3383.

[13] 苏维词.槲皮素的癌化学预防作用研究进展[J].中草药，2001，32（4）：380-381.

[14] 张军.桑叶有效成分提取与分析[D].合肥：安徽农业大学，2004.

[15] 陈丛瑾，黄克瀛，李德良，等.植物中黄酮类化合物的提取方法研究概况[J].生物质化学工程，2007，41（3）：42-46.

[16] 马嵋，张燕，张玲，等.人胃癌细胞株裸鼠皮下移植瘤模型的建立及其生物学特性[J].中国实验动物学报，2012，20（6）：57-60.

（收稿日期：2014-05-21 本文编辑：卫 轲）

1.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。其中细胞增殖的抑制率（%）=1-实验组/对照组×100%。

2 结果

3 讨论

正常环境下，血管生成是一个高度有序的过程，只有生长组织有所需求时，才会诱导单层静态内皮细胞分化及血管网络伸展。而肿瘤细胞可以通过模拟正常血管生成过程形成自身血供。肿瘤血管生成主要是通过分泌促血管生长因子，诱导内皮细胞异常增殖、迁移和形成管腔[16]。

桑叶液具有抑制内皮细胞系增殖的能力，抑制作用随着浓度的增长而增强。通过观察Transwell小室，与对照组相比添加了桑叶液的内皮细胞系，其迁移能力受到一定的制约作用。Matrigel实验中，与未加入桑叶液的内皮细胞系所形成的较完整的环状结构相比，加入桑叶液的内皮细胞系在管腔形成方面受到明显的抑制作用。实验表明，桑叶液通过抑制血管内皮细胞增殖、迁移和管腔形成，对肿瘤血管的生成具有抑制作用，从而为其制约肿瘤血管生成、切断营养与氧气供给和废弃物排泄通道、促使肿瘤细胞凋亡提供有力佐证。本研究为桑叶在肿瘤早期预防和治疗中的应用提供了实验依据，使肿瘤早期防治和低成本治疗成为可能。

关于本研究只进行了大量的定性实验，得出桑叶具有抑制血管生成的功效，具体程度尚不明确，且桑叶中的有效组分未知，在之后的研究中将就以上两个方面进一步给予探讨。

[参考文献]

[1] Folkman J. Tumor angiogenesis： therapeutic implications [J]. The New England Journal of Medicine，1971，285（21）：1182-1186.

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[3] 徐韬，许瑞安.中药及其有效成分抗肿瘤作用机制研究进展[J].华侨大学学报，2009，30，（4）：359-365.

[4] 张举，肖更生，聊森泰，等.桑叶综合利用进展[J].广东蚕业，2003，4（1）：38-41.

[5] 王芳，励建荣.桑叶的化学成分、生理功能及应用研究进展[J].食品科学，2005，26（1）：111-116.

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[7] 何雪梅，廖森泰，刘吉平.桑叶的营养功能性成分及药理作用研究进展[J].蚕业科学，2004，30（4）：390-393.

[8] 张春丽.中药对肿瘤血管生成抑制作用的研究[J].北京中医药，2011，30（2）：156-160.

[9] Wachter J，Neureiter D，Alinger B，et al. Influence of five potential anticancer drugs on wnt pathway and cell survival in human biliary tract cancer cells [J]. Int J Bid Sci，2012，8（1）：15-29.

[10] Qin Y，He LY，Chen Y，et al. Quercetin affects leptin and its receptor in human gastric cancer MGC-803 cells and JAKSTAT pathway [J]. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi，2012，28（1）：12-16.

[11] Senthilkumar K，Arunkumar R，Elumalai P，et al. Quercetin inhibits invasion，migration and signalling molecules involved in cell survival and proliferation of prostate cancer cell line （PC-3） [J]. Cell Biochem Funct，2011，29（2）：87-95.

[12] Borska S，Chmielewska M，Wysocka T，et al. In vitro effect of quercetin on human gastric carcinoma：Targeting cancer cells death and MDR [J]. Food Chem Toxicol，2012，50（9）：3375-3383.

[13] 苏维词.槲皮素的癌化学预防作用研究进展[J].中草药，2001，32（4）：380-381.

[14] 张军.桑叶有效成分提取与分析[D].合肥：安徽农业大学，2004.

[15] 陈丛瑾，黄克瀛，李德良，等.植物中黄酮类化合物的提取方法研究概况[J].生物质化学工程，2007，41（3）：42-46.

[16] 马嵋，张燕，张玲，等.人胃癌细胞株裸鼠皮下移植瘤模型的建立及其生物学特性[J].中国实验动物学报，2012，20（6）：57-60.

（收稿日期：2014-05-21 本文编辑：卫 轲）

1.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。其中细胞增殖的抑制率（%）=1-实验组/对照组×100%。

2 结果

3 讨论

正常环境下，血管生成是一个高度有序的过程，只有生长组织有所需求时，才会诱导单层静态内皮细胞分化及血管网络伸展。而肿瘤细胞可以通过模拟正常血管生成过程形成自身血供。肿瘤血管生成主要是通过分泌促血管生长因子，诱导内皮细胞异常增殖、迁移和形成管腔[16]。

桑叶液具有抑制内皮细胞系增殖的能力，抑制作用随着浓度的增长而增强。通过观察Transwell小室，与对照组相比添加了桑叶液的内皮细胞系，其迁移能力受到一定的制约作用。Matrigel实验中，与未加入桑叶液的内皮细胞系所形成的较完整的环状结构相比，加入桑叶液的内皮细胞系在管腔形成方面受到明显的抑制作用。实验表明，桑叶液通过抑制血管内皮细胞增殖、迁移和管腔形成，对肿瘤血管的生成具有抑制作用，从而为其制约肿瘤血管生成、切断营养与氧气供给和废弃物排泄通道、促使肿瘤细胞凋亡提供有力佐证。本研究为桑叶在肿瘤早期预防和治疗中的应用提供了实验依据，使肿瘤早期防治和低成本治疗成为可能。

关于本研究只进行了大量的定性实验，得出桑叶具有抑制血管生成的功效，具体程度尚不明确，且桑叶中的有效组分未知，在之后的研究中将就以上两个方面进一步给予探讨。

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[1] Folkman J. Tumor angiogenesis： therapeutic implications [J]. The New England Journal of Medicine，1971，285（21）：1182-1186.

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[5] 王芳，励建荣.桑叶的化学成分、生理功能及应用研究进展[J].食品科学，2005，26（1）：111-116.

[6] 欧阳臻，陈钧.桑叶的化学成分及其药理作用研究进展[J].江苏大学学报：自然科学版，2003，24（6）：39-43.

[7] 何雪梅，廖森泰，刘吉平.桑叶的营养功能性成分及药理作用研究进展[J].蚕业科学，2004，30（4）：390-393.

[8] 张春丽.中药对肿瘤血管生成抑制作用的研究[J].北京中医药，2011，30（2）：156-160.

[9] Wachter J，Neureiter D，Alinger B，et al. Influence of five potential anticancer drugs on wnt pathway and cell survival in human biliary tract cancer cells [J]. Int J Bid Sci，2012，8（1）：15-29.

[10] Qin Y，He LY，Chen Y，et al. Quercetin affects leptin and its receptor in human gastric cancer MGC-803 cells and JAKSTAT pathway [J]. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi，2012，28（1）：12-16.

[11] Senthilkumar K，Arunkumar R，Elumalai P，et al. Quercetin inhibits invasion，migration and signalling molecules involved in cell survival and proliferation of prostate cancer cell line （PC-3） [J]. Cell Biochem Funct，2011，29（2）：87-95.

[12] Borska S，Chmielewska M，Wysocka T，et al. In vitro effect of quercetin on human gastric carcinoma：Targeting cancer cells death and MDR [J]. Food Chem Toxicol，2012，50（9）：3375-3383.

[13] 苏维词.槲皮素的癌化学预防作用研究进展[J].中草药，2001，32（4）：380-381.

[14] 张军.桑叶有效成分提取与分析[D].合肥：安徽农业大学，2004.

[15] 陈丛瑾，黄克瀛，李德良，等.植物中黄酮类化合物的提取方法研究概况[J].生物质化学工程，2007，41（3）：42-46.

[16] 马嵋，张燕，张玲，等.人胃癌细胞株裸鼠皮下移植瘤模型的建立及其生物学特性[J].中国实验动物学报，2012，20（6）：57-60.

（收稿日期：2014-05-21 本文编辑：卫 轲）