白木香愈伤组织的诱导及培养

董闪+李明+唐堃+赵盼+赵冬+潘雪峰

摘要：以白木香[Aquiliaria sinensis （Lour.） Gilg]无菌苗为试验材料，研究不同激素对其愈伤组织诱导以及生长的影响。结果表明，适合白木香无菌苗诱导愈伤组织的外植体为茎段，适合诱导愈伤组织的6-BA浓度为1.0 mg/L。白木香愈伤组织在MS+0.1 mg/L 6-BA培养基中丛生芽的诱导效果最好；在MS+1.0 mg/L 6-BA的培养基中继代培养后愈伤组织的增殖量最多；在MS+1.0 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA培养基中继代培养后愈伤组织的细胞活力最大。

关键词：白木香[Aquiliaria sinensis （Lour.） Gilg]；愈伤组织诱导；组织培养；细胞活力

中图分类号：R282；Q813.1+2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）15-3673-05

Callus Induction and Tissue Culture of Aquiliaria sinensis （Lour.） Gilg

DONG Shan，LI Ming，TANG Kun，ZHAO Pan，ZHAO Dong，PAN Xue-feng

（School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006， China）

Abstract： Using the aseptic seedling of Aquiliaria sinensis （Lour.） Gilg as materials， the effects of different hormones on induction and tissue culture of callus were studied. The results showed that the explant of aseptic seedling of Aquiliaria sinensis（Lour.） Gilg suitable to induce callus was stem. The appropriate concentration of 6-BA was 1.0 mg/L. Cespitose buds was best induced from callus of Aquiliaria sinensis（Lour.） Gilg in the medium MS+0.1 mg/L 6-BA. The proliferation reached its maximum after subcultured in the medium MS+1.0 mg/L 6-BA. The cell viability reached its maximum after subcultured in the medium MS+1.0 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA.

Key words： Aquiliaria sinensis （Lour.） Gilg；callus induction；tissue culture；cell viability

收稿日期：2014-03-25

基金项目：广东省科技计划项目（2011B031700067）；中山市科技计划项目（20101H022）；广东药学院中药学重点学科专项基金资助

作者简介：董 闪（1989-），男，湖北广水人，在读硕士研究生，研究方向为中药资源与质量，（电话）13450281721（电子信箱）dongshan0220@126.com；

通讯作者：李 明（1963-），女，黑龙江五常人，主要从事药用植物资源生态及质量控制研究，（电话）13539843803（电子信箱）

13539843803@163.com。

白木香[Aquiliaria sinensis （Lour.） Gilg]又名土沉香，其含黑棕色树脂的心材可加工成国产沉香，具有重要的药用价值以及商业价值[1]。因白木香的自然繁殖率低，同时受到过量开采，其野生资源锐减，现已列入国家三级濒危植物[2]。近年来，有些学者对白木香的资源保护以及人工结香进行了研究，并取得了一定成果[3]。本研究在前人研究的基础上，对白木香不同类型愈伤组织的诱导方法进行分析，比较了不同外植体（茎段、根段、子叶、叶片）和激素（6-BA、NAA、2，4-D）对愈伤组织培养的影响，以期为白木香结香机理和快繁技术的研究提供理想的材料。

1 材料与方法

1.1 材料

供试白木香种子采自广东药学院大学城校区药圃，经广东药学院李明教授鉴定为瑞香科沉香属白木香的种子。

1.2 无菌苗的培养

选择外形饱满、质地坚硬的新鲜种子，去掉种皮，用75%乙醇浸泡30 s，0.1%升汞消毒5 min，无菌水洗净后，接种于含有3%蔗糖和0.6%琼脂的培养基中，每瓶接3粒种子。培养条件为温度（26±1） ℃，光照度2 000 lx，光照时间12 h/d。

1.2 愈伤组织的诱导

以萌发40～50 d、生长正常的白木香无菌苗为试验材料，切取茎段、根段、子叶、叶片作为外植体，分别接入添加了不同浓度6-BA（0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L）的培养基中，基本培养基为MS，附加3%的蔗糖、0.6%的琼脂，pH 5.8。每种浓度处理20瓶，每瓶接种相同外植体3株。诱导条件为温度（25±1） ℃，光照度2 000 lx，光照时间12 h/d。接种后每隔7 d观察记录一次诱导情况，28 d后统计结果。

1.3 丛生芽的诱导endprint

选取白木香无菌苗的茎段作为丛生芽诱导材料，分别接种于含有不同浓度6-BA（0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L）的培养基中，基本培养基为MS，附加3%的蔗糖、0.6%的琼脂，pH 5.8，诱导条件同上。每组接种10瓶，每瓶接种2株，生长28 d后统计出芽情况。

1.4 愈伤组织的继代培养

以MS+1.0 mg/L 6-BA培养基中由茎段诱导出的愈伤组织作为继代材料，先接种于不添加任何激素的MS培养基中生长7 d，再取长势稳定、颜色正常的愈伤组织接种于添加了不同激素的培养基中进行继代培养，设12组处理（表1）。每组处理10瓶，每瓶接种愈伤组织1株，每株接入的愈伤组织鲜重0.25 g。基本培养基为MS，附加3%的蔗糖、0.6%的琼脂，pH 5.8。继代培养条件同上。接种28 d后测定愈伤组织的鲜重和细胞活力。

1.5 白木香愈伤组织活力的测定

一般采用TTC法检测植物种子和根系的活力，有研究将TTC法用于冷冻细胞活力的检测[4]。本试验采用的TTC法参考王跃华等[5]的研究结果，并略加修改，取0.25 g愈伤组织，加0.4% TTC溶液2.5 mL和pH 7的磷酸缓冲液2.5 mL染色4 h，去除染色液，加5 mL甲醇溶解，60 ℃水浴30 min后取溶液检测其吸光度。

2 结果与分析

2.1 不同外植体对白木香愈伤组织诱导的影响

接种28 d后，4种白木香外植体的愈伤组织诱导率如表2所示。由表2可知，白木香茎段的诱导率最高，在添加了1.0、2.0 mg/L 6-BA的培养基中诱导率均达到100%；白木香根段和子叶的愈伤组织诱导率最高分别为53%和57%，培养过程中观察发现根段出愈时间较晚，子叶容易褐化，二者诱导出的愈伤组织颜色淡绿，生长速度也较为缓慢；叶片在本试验设置的条件下没有诱导出愈伤组织。

2.2 不同浓度6-BA对白木香愈伤组织诱导的影响

不同浓度6-BA对3种白木香外植体（茎段、根段、子叶）愈伤组织诱导的影响，结果如图1至图3。从图1可知，对照组（未添加激素）的白木香茎段愈伤组织诱导率较低，添加6-BA后愈伤组织的诱导率明显提高，且添加的6-BA浓度越高，诱导率也越高；培养21 d，当6-BA浓度为1.0 mg/L时，诱导率达到100%。

比较不同浓度6-BA对白木香无菌苗根段和子叶愈伤组织诱导率的影响，结果（图2、图3）表明，不同浓度6-BA对白木香无菌苗根段和子叶的诱导率要低于对茎段的诱导率，根段和子叶在高浓度（2.0、1.0 mg/L）6-BA作用下的诱导率高于中低浓度（0.5、0.2、0.1 mg/L）6-BA作用下的诱导率。在高浓度6-BA的作用下，大部分愈伤组织均在14 d被诱导出，21 d时趋于平稳，而在低浓度（0.2、0.1 mg/L）6-BA的作用下，根段和子叶的大部分愈伤组织在21 d时才被诱导出，说明高浓度6-BA作用下诱导出白木香愈伤组织的时间较早。

2.3 不同浓度6-BA对白木香丛生芽诱导的影响

白木香茎段接种28 d后，统计长度在1 cm以上的芽的个数，结果如表3所示。由表3可知，通过比较不同浓度6-BA对白木香丛生芽诱导的影响，发现低浓度的6-BA对丛生芽诱导的效果较明显，0.1 mg/L 6-BA诱导出丛生芽的数量最多，0.2 mg/L 6-BA诱导出丛生芽的出芽率最高；随着6-BA浓度的升高，白木香丛生芽的出芽数和出芽率逐步减少，说明低浓度（0.2、0.1 mg/L）的6-BA比较适合白木香丛生芽的诱导。

2.4 不同激素对白木香愈伤组织继代培养的影响

2.4.1 不同激素对白木香愈伤组织增殖的影响 在添加了不同激素的培养基中继代28 d后，白木香愈伤组织鲜重增加量和增殖倍数如表4所示。从表4可以看出，只添加6-BA时，白木香愈伤组织增殖倍数较高，中浓度（1.0 mg/L）和高浓度（2.0 mg/L）6-BA作用下的增殖倍数分别达到了3.16和3.12，但高浓度6-BA培养下个体增殖差异较大，样本数据不稳定。只添加KT时，愈伤组织增殖倍数较小，表明KT不适合白木香愈伤组织的增殖培养。

比较不同生长素NAA、2，4-D与6-BA组合对白木香愈伤组织增殖的影响，发现NAA浓度越高，增殖倍数越低，表明低浓度（0.1 mg/L）的NAA与6-BA组合比较适合白木香愈伤组织的增殖；2，4-D浓度越高，增殖倍数越高，表明高浓度（2.0 mg/L）的2，4-D与6-BA组合比较适合白木香愈伤组织的增殖。比较2种生长素发现，NAA与6-BA组合下白木香愈伤组织的增殖倍数比2，4-D与6-BA组合下白木香愈伤组织的增殖倍数要高。

2.4.2 不同激素对白木香愈伤组织生长状态和细胞活力的影响 在含有不同激素的培养基中继代28 d后，白木香愈伤组织的形态如图4所示，用TTC法测定其细胞活力，结果如表5所示。结果表明，在培养基中添加6-BA和中、低浓度（0.1、0.2 mg/L）的NAA后继代出的愈伤组织状态较好，颜色为淡绿色、质地疏松、生长稳定，测定出其吸光度值分别达到了1.099和1.089。在只添加6-BA的培养基中继代后，愈伤组织颜色多为深绿色、质地致密，吸光度值也低于前者。2，4-D与6-BA组合继代培养中，白木香愈伤组织颜色多为淡黄色、质地疏松，其中高浓度（2.0 mg/L）2，4-D与6-BA组合下培养出的愈伤组织活力较高，吸光度值达1.011。只添加KT时，培养出的愈伤组织颜色为淡绿色，生长缓慢，出现褐化，其细胞活力也较低。

3 小结与讨论

在植物愈伤组织的诱导中，不同外植体对愈伤组织诱导的影响较大[6]，本研究以白木香无菌苗为试验材料，结果表明最适合白木香诱导愈伤组织的外植体为茎段，其次为根段和子叶，叶片不适合愈伤组织诱导。其中，茎段在含有1.0 mg/L和2.0 mg/L 6-BA的MS培养基中愈伤组织诱导率均达到了100%，这主要是因为采用无菌苗作为试验材料避免了消毒对外植体的损害，提高了愈伤组织诱导的成功率[7]。本研究首次采用白木香无菌苗的根段诱导愈伤组织，并发现其在MS+1.0 mg/L 6-BA的培养基中诱导率达到53%，表明白木香无菌苗根段具有诱导愈伤组织的能力。在不同浓度6-BA的作用下，子叶愈伤组织的诱导率普遍较低，最高只达到了57%，这可能与无菌苗的苗龄过长有关[8]，大部分子叶在接种时都已经失活。叶片则无法诱导出愈伤组织，这可能与诱导环境中光照过强有关，如杜勤等[9]在初步研究白木香愈伤组织的诱导中发现暗培养更适合白木香叶片的愈伤组织诱导。endprint

细胞分裂素在组织培养中常用于诱导细胞分裂和茎的分化增殖，6-BA是第一个人工合成的细胞分裂素，具有防止细胞老化、促进细胞分裂、非分化组织分化、生物体内物质积累、侧芽发生等特点[10]，在白木香组织培养中也常将6-BA作为诱导愈伤组织的主要激素[3，9，11]。本研究分析了不同浓度6-BA对白木香愈伤组织诱导的影响，结果表明高浓度（1.0、2.0 mg/L）6-BA作用下愈伤组织的诱导率较高，被诱导出的时间较早；低浓度（0.1、0.2 mg/L）6-BA作用下愈伤组织的诱导率较低，被诱导出的时间较晚，但丛生芽的诱导率较高，这点与叶勤法等[12]在研究白木香组织快繁技术中得到的结论一致。

愈伤组织在不同植物激素的作用下会形成不同形态的愈伤组织[13]，KT与6-BA均为细胞分裂素，二者化学结构和生理功能也较为相似，本研究对比2种分裂素对白木香愈伤组织继代培养的影响，结果表明KT作用下愈伤组织的增殖倍数和细胞活性显著低于6-BA作用下愈伤组织的增殖倍数和细胞活性，表明KT不适合白木香愈伤组织的继代培养。细胞分裂素与生长素的比例高低对愈伤组织的诱导和分化会起到不同的作用[6]，将6-BA与NAA和2，4-D分别组合后，新生的愈伤组织质地较松软，颜色也较浅，与只添加6-BA相比，其细胞活性略有提高，但愈伤组织的增殖倍数显著降低。进一步观察发现，6-BA与NAA组合培养出的愈伤组织颜色多为浅绿色；6-BA与2，4-D组合培养出的愈伤组织颜色多为淡黄色，其生长速度和细胞活性都略低于前者，关于这2种愈伤组织的细胞分化能力、丛生芽诱导能力等方面的差别尚在研究中。

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