肾炎康胶囊主要原料药质量标准研究

李启照,戴 一，薛志红

肾炎康胶囊主要原料药质量标准研究

*李启照,戴 一，薛志红

(安徽新华学院药学院，安徽，合肥 230088)

建立肾炎康胶囊原料药材（三七、黄芪、益母草、决明子、接骨木）的质量标准。采用薄层色谱法（TCL）对肾炎康胶囊中原料药材进行定性鉴别，采用高效液相色谱法测定三七药材中人参皂苷Rb1、Rg1和三七皂苷R1的含量。薄层色谱鉴别专属性强；三种皂苷的加样回收率试验的平均回收率分别为98.39%、97.15%、98.32%，RSD分别为1.45、1.17、1.47，符合质量要求。所用方法简便、准确，完善了肾炎康胶囊原料药材的质量标准，可作为血利康软胶囊的质量控制标准。

肾炎康胶囊；薄层色谱法；高效液相色谱法；质量标准

肾炎康胶囊为常用中药制剂，主要成分有三七、黄芪、益母草、决明子、接骨木等五味中药加工制成。常用于慢性肾小球肾炎。为更好地控制该产品质量及用药安全性，对肾炎康胶囊的质量标准进行研究，完善肾炎康胶囊质量标准。三七为处方中君药，原标准没有测定项，采用高效液相色谱法对三七的主要成分人参皂苷Rb1、Rg1和三七皂苷R1的含量进行测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪(Waters2695）：Empower工作站；KQ-100B型超声波清洗器（昆山超声仪器公司）BPZ11D型电子分析天平（Sartorius公司）；硅胶G薄层板（山东烟台化学工业研究所）。

1.2 药物与试剂

三七、黄芪、益母草、决明子、接骨木均购与安徽国医堂，由安徽新华学院药学院中药教研室鉴定；人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1对照品均购自中国药品生物制品检定所；乙腈为色谱纯，正丁醇、氯仿、醋酸乙酯、硫酸、乙醚、甲醇、苯、硫酸等试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 鉴别试验

2.1.1 三七的TLC鉴别

供试品溶液制备：取三七细粉0.5 g，加水5滴，搅拌均匀，再加入以水饱和的正丁醇5 mL，振摇10 min，静置2 h，离心分离取上清液，以正丁醇饱和的水3倍量加入，摇匀，静置离心分离，取正丁醇层溶液蒸干，加1 mL甲醇使残渣溶解，作为供试品溶液。另取对照品人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1及对照品三七皂苷R1，制成每1 mL各含0.5 mg的甲醇混合溶液，作为对照品溶液。对照2010版药典薄层色谱法试验，各吸取1 μL上述两种溶液，点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-甲醇-水（40:15:22:10）配制，在10℃以下放置，取下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸溶液（1→10），在105℃加热至斑点显色清晰。实验结果在供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；在365 nm紫外光灯下检视，荧光斑点相同，结果见图1。

1：三七皂苷R1；2：人参皂苷Rb1；3：人参皂苷Re；4：人参皂苷Rg1；5：肾炎康胶囊胶囊；6：三七药材；7：阴性对照

2.1.2 黄芪的TLC鉴别

供试品溶液制备：取黄芪药材粉末2.0 g，用甲醇20 mL超声处理30 min，过滤，所得滤液蒸干，残渣加0.3%氢氧化钠溶液15 mL使其溶解，滤过，滤液用稀盐酸调pH到5~6，用乙酸乙酯15 mL提取，分取乙酸乙酯液，用铺有适量无水硫酸钠的滤纸滤过，蒸干滤液。残渣用乙酸乙酯1 mL溶解，作为供试品溶液[1]。另取黄芪对照药材1.0 g 用甲醇制成1 mL含1 mg的溶液，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（附录Ⅵ B）试验，吸取供试品、对照药材溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（10:1）下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，用氨气中熏后在365 nm紫外光灯下检视，在供试品色谱与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；结果见图2。

1-2：供试品；3：阴性对照；4-5：黄芪对照药材

2.1.3 益母草的TLC鉴别

供试品溶液制备：取益母草粉末3.0 g，加乙醇20 mL，超声处理20 min，过滤，所得滤液蒸干，加无水乙醇1 mL使残渣溶解，制得供试品溶液。另取益母草对照药材1.0 g，同法制成对照药材溶液[2]。对照2010版药典薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5 μL，在同一硅胶G薄层板上分别点样，以正丁醇-盐酸-水(8:2:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱与对照药材色谱在相应的位置上显相同颜色的斑点。在365 nm紫外光灯下检视，显相同的荧光斑点，结果见图3。

1-2：供试品；3：肾炎康胶囊阴性对照；4-5：益母草对照药材

2.1.4 决明子的TLC鉴别

供试品溶液制备：取决明子粉末1.0 g，用甲醇10 mL浸润1 h，过滤，所得滤液蒸干，加水10 mL使残渣溶解，加盐酸1 mL水浴加热30 min，静置冷却后用20乙醚提取3次，合并滤液，蒸干残渣后加三氯甲烷1.0 mL使其溶解，作为供试品溶液。另取决明子对照药材1.0 g，同法制成对照药材溶液[3]。对照2010版药典薄层色谱法试验，分别吸取供试品溶液及对照药材溶液各5 μL，点于同一硅胶G薄层板相应位置，以石油醚-甲酸乙酯-甲酸（15:5:1）上层溶液为展开剂，展开后，取出，晾干，置365 nm紫外光灯下检视。供试品色谱与对照药材色谱在相应的位置上显相同颜色的斑点，结果见图4。

1-2：供试品；3：肾炎康胶囊阴性对照；4-5：决明子对照药材

2.2 定量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm × 4.6 mm)；流动相：乙腈-0.2%冰醋酸（15:85）为流动相A，水为流动相B，进行梯度洗脱[4]；流速为1 mL/min，检测波长203 nm，柱温30 ℃。理论板数按三七皂苷R1峰计算应不低于4000。

2.2.2对照品溶液的制备和线性关系考察

精密称取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1对照品和人参皂苷Rb1对照品适量，用甲醇分别制成含三七皂苷R10.20 mg、人参皂苷Rg10.40 mg/mL、人参皂苷Rb10.40 mg的混合溶液[5]。分别吸取上述溶液4、8、12、16、20 μL，按上述色谱条件测定峰面积。①以进样量和峰面积进行线性回归( n = 5)，回归方程和相关系数为:= 86396+74748,2= 0. 9994 ( n = 5)。人参皂苷Rg1标准曲线以峰面积为纵坐标，以对照品溶液进样量（μL）为横坐标，绘制标准曲线。结果表明:人参皂苷Rg1在1.67~8.200 μg 范围内与峰面积线性关系好。

表1 人参皂苷Rg1线性关系考察表

以进样量和峰面积进行线性回归（n = 5），回归方程和相关系数为：= 57178– 189.1,2= 0. 9998 ( n = 5) 。人参皂苷Rb1标准曲线：以峰面积为纵坐标，以对照品溶液进样量（μL）为横坐标，绘制标准曲线。结果表明:人参皂苷Rb1在1.56~7.84 μg 范围内与峰面积线性关系良好。

表2 人参皂苷Rb1线性关系考察表

Table 2 Test table of ginsenoside Rb1 linear relation

三七皂苷R1标准曲线：以进样量和峰面积进行线性回归(n = 5) , 回归方程和相关系数为:= 13267– 1578.9,2= 0. 9994 (n = 5) 。以峰面积为纵坐标，以对照品溶液进样量(μL)为横坐标，绘制标准曲线。结果表明:三七皂苷R1在0.426~2. 17 μg 范围内与峰面积线性关系良好。

表3 三七皂苷R1线性关系考察表

2.2.3 精密度试验

精密吸取上述对照品溶液10 μL进样，重复5次，测得峰面积，结果见表4。

表4 精密度试验考察表

结果表明：该仪器精密度良好。

2.2.4重现性试验

供试品溶液制备：精密称取每份0.6 g同一批药材粉末5份，加入甲醇溶液50 mL，精密称定重量，放置过夜，与80 ℃水浴上微沸保持2 h，静置放冷，精密称定，用甲醇补足减失的重量再称定，摇匀，过滤，制得供试品溶液[6]。精密吸取5份上述溶液各10 μL，进样，测得峰面积，计算其含量，结果见表5。

表5 重现性试验考察表

结果表明：该试验方法重现性良好。

2.2.5 稳定性试验

供试品溶液制备：精密称取药材粉末0.6 g，加入50 mL甲醇，称定重量，放置过夜，在80 ℃水浴上微沸2 h，静置放冷，精密称重；减失的重量用甲醇补足称重，摇匀，过滤，制得供试品溶液。间隔2 h精密吸取上述溶液各10 μL进样，测得峰面积，结果见表6。

表6 稳定性性试验考察表

结果表明：该试验8 h内测量值稳定性良好。

2.2.6 加样回收试验

供试品溶液制备：精密称取每份60 mg已知含量的药材粉末5份，各加入三角烧瓶中，再上述5个三角烧瓶中精密称取人参皂苷Rb1、、人参皂苷Rg1、和三七皂苷R1适量，按照上述方法制取供试品溶液。再精密吸取上述溶液10 μL，进样，测得峰面积，实验结果见表7，表8，表9：

表7 人参皂苷Rg1加样回收试验结果

表8 人参皂苷Rb1加样回收试验结果

表9 三七皂苷R1加样回收试验结果

实验结果表明：三种皂苷的加样回收率试验的平均回收率分别为97.15%、98.39%、98.32%，RSD分别为1.17、1.45、1.47，符合质量要求。

2.2.7 供试品溶液的制备

供试品溶液的制备：取过四号筛本品粉末0.6 g，精密称定，加入甲醇50 mL，放置过夜，在80 ℃水浴上微沸2 h，静置放冷，精密称定，减失的重量用甲醇补足，精密称定，摇匀，过滤，取滤液，即得供试品溶液。

2.2.8 样品的测定

对照中国药典2010年版附录高效液相色谱法测定，分别精密吸取上述供试品和对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录对照品峰面积各分值与供试品峰面积积分值，计算三批三七药材粗粉中人参皂苷Rg1人参皂苷Rb1三七皂苷R1的总含量为：72.46、73.79、72.77 mg/g。

图5 对照品的HPLC图谱

Fig 5 HPLC map of control products

图6 药材的HPLC图谱

图7 人参皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1混合对照品HPLC图谱

图8 三七药材HPLC图谱

3 讨论

中成药质量标准的研究一般多以TLC和HPLC方法考察为主，采用合适的指标建立其标准[7]。本实验以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1为指标，采用TLC和HPLC建立肾炎康胶囊原料药材的质量标准。三七薄层色谱鉴别中，供试品色谱在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；置紫外光灯（365 nm）下检视，显相同的荧光斑点。益母草、黄芪、决明子薄层色谱鉴别中，供试品色谱在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，斑点对应性好，阴性对照无干扰，专属性强。定量测定中样品处理容易、可控，所建立的色谱条件简单，分析时间在规定时间之内，等度洗脱，适宜肾炎康胶囊原料药材的含量测定。

[1] 胡克菲,张卫华,郑清娉,等.HPLC同时测定红药凝胶中人参皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1含量[J].中成药,2010,31(9):1382-1385.

[2] 李霄, 万丹丹,郭洛宏.薄层色谱对复方丹参片中三七皂苷R1 和人参皂苷Re的鉴别[J].中成药,2009，31(9): 1470-1472.

[3] 孟舒,姜泓,陈再兴,等.高效液相色谱法测定玄丹巴布剂中三七皂苷R1和人参皂苷Rg1含量[J].中国医院药学杂志,2009，29(12):1057-1059.

[4] 冷静,杨华蓉,林大胜,等. 三七三醇皂苷及制剂的LC - MS指纹图谱研究[J]. 华西药学杂志, 2010, 24(5)：503-505.

[5] 宋宏新,刘静,张彦娟.半仿生酶法提取三七皂苷工艺研究[J].中草药,2009，40(6):905-907.

[6] 赖春花，郑琴，杨明,等.三七总皂苷肠溶微丸的制备及处方工艺优化[J].中国中药杂志,2009,34(11): 1359-1363.

[7] Liu B S, Huang T B, Yao C H, et al. Novel wound dressing of non-woven fabric coated with genipin- crosslinked chitosan and bletilla striata herbal extract[J]. Journal of Medical and Biological Engineering, 2009, 29(2):60-67.

QUALITY STANDARD OF THE MAIN CRUDE DRUGS IN NEPHRITIS CAPSULE

*LI Qi-zhao，DAI Yi, XUE Zhi-hong

(School of Medicine, Anhui Xinhua University, Hefei, Anhui 230088, China)

：To establish the quality standards of nephritis capsule raw materials (three seven, astragalus root, motherwort herb, cassia seed, elderberry).: Using thin layer chromatography (TLC) for the identification of medicinal materials of nephritis capsule, using high performance liquid chromatography method for the content determination of ginseng ginsenoside Rb1, Rg1 and three seven ginsenoside R1.: TLC identification has high specificity. The average recovery rates of three kinds of saponins in the recovery test of the added sample are 98.39%, 97.15% and 98.32%, RSD are 1.45, 1.17 and 1.47, respectively, which meets the requirements.: The method is simple, accurate, perfects the quality standard of the raw materials in nephritis capsule. It could be used as the control standards of blood Likang soft capsule quality.

nephritis capsule; TLC; HPLC; quality standard

R927.11

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2014.03.022

1674-8085(2014)03-0093-05

2014-01-07；

2014-04-06

安徽教育厅自然科学研究项目(KJ2011B071)；安徽新华学院校级质量工程项目(2011Rcpyx01，2012xwsjx07，2013xqjdx01)

*李启照(1970-)，男，安徽金寨人，讲师，主要从事药物合成研究(E-mail:liqizhao2009@126.com);

戴 一(1979-)，男，安徽利辛人，讲师，主要从事药物化学研究(daiyiii@sina.cn)；

薛志红(1978-)，男，安徽阜阳人，讲师，主要从事药物制剂研究(xue0588@126.com).