双功能促胰岛素水蛭素（5rolGLP－HV）的构建及功能分析

张耀方，马百成，屠培培，李 宠，马志华，姬艳丽，董 震，马 超，郝军凤，李晓丹，王 宇，李明刚

（1.南开大学 生命科学学院，分子生物学研究所，生物活性材料教育部重点实验室，天津300071；2.天津农学院，天津300384）

胰高血糖样多肽1（glucagon－like peptide－1，GLP－1）是由肠道L细胞合成与分泌的30个氨基酸组成的多肽.研究表明，GLP－1具有显著增强葡萄糖依赖性的胰岛素分泌、减少食物摄取、减慢胃排空、抑制胰高血糖素分泌、刺激胰腺β细胞增殖、促进胰岛再生和抑制胰腺β细胞凋亡等作用［1－5］.目前，GLP－1及其相关新药的研发已引起人们广泛关注［6］.

水蛭素（hirudin）是从医蛭（hirudomedieinalis）唾液腺中分离提纯的一种酸性小分子蛋白质，一般由65或66个氨基酸组成，分子量约为7 000.水蛭素可预防深静脉血栓的形成［7－8］、急性冠脉综合症、心肌梗死［8－9］以及肝素诱导的血小板减少症等［10］，可有效对抗脑出血损伤［11］并抑制肿瘤细胞的增殖［12］.由于水蛭素分子稳定性极高，能耐受酸碱变化、高温及各种蛋白酶的降解作用，因此可作为口服抗栓剂［7］.目前重组水蛭素在临床上已经得到广泛应用.

人体内存在的二肽酶Ⅳ（DPP－Ⅳ）可特异性识别GLP－1肽链N端第2位的Pro或Ala残基，若在肽链的N端切除这两个氨基酸，则GLP－1在体内很快被降解为无生物活性的GLP－1（9－36）－NH2和GLP－1（9－37）［13－15］，其生物半衰期约为2min［16］，限制了其在临床上的应用.本文克隆了抗 DPP－Ⅳ和胰蛋白酶降解的GLP－1类似物，命名为重组口服长效促胰岛素（recombinant oral long－acting GLP－1，rolGLP－1），并采用融合表达技术将改进后的5个拷贝重组口服长效rolGLP－1与rHV基因串联，得到了能防治糖尿病及其血栓并发症的口服长效促胰岛素水蛭素（5rolGLP－HV）.

1 材料与试剂

1.1 菌株和质粒

大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）、pET22b（＋）及pMD18－T（含有rolGLP－1片段或rolGLP－HV 片段）均由南开大学生物技术与新药实验室保存；rolGLP－1蛋白由南开大学生物技术与新药实验室提供.

1.2 试剂和酶

限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶和5′磷酸化酶均购自日本TaKaRa公司；pfuDNA聚合酶购自北京鼎国生物工程有限公司；链脲佐菌素（STZ）购自美国Sigma公司；卡拉胶购自广东肇庆海星食品工业有限公司；Ni－NTA购自瑞典Pharmacia公司；引物由上海生物工程有限公司合成，引物设计列于表1.

表1 引物设计Table 1 Prime design

2 实验方法

2.1 pET22b（＋）－5rolGLP－HV 的构建

5rolGLP－HV基因构建过程如图1所示.将rolGLP－1上游、rolGLP－1下游和rolGLP－rHV上游引物磷酸化，分别命名为P－rolGLP－1上游，P－rolGLP－1下游和P－rolGLP－HV；以P－rolGLP－1上游和rolGLP－1下 游 为 引物，pMD18－T－rolGLP－1 为 模 板 扩 增 P－rolGLP－1；以rolGLP－1 上 游 和P－rolGLP－1下游为引物，pMD18－T－rolGLP－1为模板扩增rolGLP－1－P；T4连接酶将rolGLP－1－P和P－rolGLP－1连接，分别以5rolGLP－1上游和P－rolGLP－1下游为引物，以连接液为模板扩增2rolGLP－1－P；以P－rolGLP－1上游和XbaⅠ－rHV下游为引物，以pMD18－T－rolGLP－HV 为模板扩增P－rolGLP－HV；T4 连 接 酶 将 2rolGLP－1－P 和 P－rolGLP－HV 连 接， 以 P－rolGLP－1 上 游 和XbaⅠ－rHV下游为引物，连接液为模板扩增 P－3rolGLP－HV；T4连接酶将2rolGLP－1－P 和P－3rolGLP－HV 连接， 以 5rolGLP－1 上 游 和XbaⅠ－rHV下游为引物，扩增5rolGLP－HV；分别以5rolGLP－HV－His上游和5rolGLP－HV－His下游为引物，以5rolGLP－HV 为模板扩增5rolGLPHV－6 His.

将5rolGLP－HV－His基因片段和pET22b（＋）载体分别以KpnⅠ和HindⅢ酶切后T4连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，对鉴定为阳性的质粒测序.阳性质粒命名为pET22b（＋）－5rolGLP－HV.

图1 pET－22b（＋）－5rolGLP－HV 的构建过程Fig.1 Schematic illustration of pET－22b（＋）－5rolGLP－HVconstruction

2.2 5rolGLP－HV的表达和纯化

2.2.1 5rolGLP－HV的表达 将测序正确的重组质粒pET22b（＋）－5rolGLP－HV 转化入大肠杆菌BL21（DE3），挑取单菌落，接种于LB液体培养基（含100mg／L氨苄青霉素）中，37℃振荡培养过夜.再将菌液以1∶100接种于新鲜LB液体培养基中，37℃振荡培养至A600≈0.8，加入异丙基硫代－β－D 半乳糖苷（IPTG）至其终浓度为0.6mmol／L，37℃振荡培养4h.4℃离心后收集菌体.诱导前的菌体为对照，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）分析.

2.2.2 5rolGLP－HV的Western blot鉴定 先将表达的5rolGLP－HV全菌体经质量分数为12%的SDS－PAGE电泳后，再将蛋白条带转印至醋酸纤维素膜上，在含50g／L脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液（PBS）中4℃封闭过夜，以小鼠抗人GLP－1为一抗，辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠lgG为二抗，进行常规的Western blot检测，并用二氨基联苯胺（DAB）显色.

2.2.3 5rolGLP－HV的纯化 将IPTG诱导表达后的菌液4℃离心收集菌体.Tris－HCl缓冲液重悬菌体，超声破碎，离心，取上清液和沉淀进行SDS－PAGE分析.

先以10倍柱体积的Tris－HCl洗柱，裂解上清液上样，用10倍柱体积的Tris－HCl平衡柱体，含20mmol／L咪唑的Tris－HCl缓冲液（pH＝8.0）洗脱杂蛋白，再用含250mmol／L咪唑的Tris－HCl缓冲液（pH＝8.0）洗脱目的蛋白.最后用质量分数为12%SDS－PAGE电泳检测分析.将目的蛋白透析除盐，－80℃保存备用.

2.3 5rolGLP－HV对小鼠空腹血糖的影响

将雄性3周龄的C57／BL小鼠（体质量（12±1）g）随机分为两组.正常组（n＝7）：喂食正常饲料；高脂高糖组：喂食高脂高糖饲料.喂食2个月后，将高脂高糖组小鼠腹腔注射链脲佐菌素（STZ）溶液100mg／kg，4周后，断尾取血检测小鼠空腹血糖，血糖值大于11mmol／L的即为造模成功的Ⅱ型糖尿病小鼠（n＝28）.将造模成功的糖尿病小鼠随机分为4组（n＝7）进行口服灌胃治疗.阴性对照组：灌胃生理盐水；阳性药组：灌胃二甲双胍300mg／kg；5rolGLP－HV实验组：灌胃16mg／kg的5rolGLPHV蛋白；rolGLP－1组：灌胃16mg／kg的rolGLP－1蛋白.连续灌胃3周，每隔7d检测一次空腹血糖值.

2.4 5rolGLP－HV的抗血栓活性检测

将昆明小鼠随机分为2组.对照组（n＝5）：背部皮下注射50mg／kg质量分数为3%的卡拉胶溶液，并灌胃质量分数为0.9%的生理盐水；实验组（n＝5）：背部皮下注射50mg／kg质量分数为3%的卡拉胶溶液，并灌胃16mg／kg的5rolGLP－HV.观察小鼠尾部血栓形成的时间及长度.

3 结果与分析

3.1 pET22b（＋）－5rolGLP－HV 的构建

重组表达质粒pET22b（＋）－5rolGLP－HV的PCR产物经质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳分析，在500～750bp内可见特异性DNA片段（图2（A））；经KpnⅠ和HindⅢ双酶切可见约5 400bp的载体片段和约700bp的目的基因片段（图2（B））.对重组质粒pET22b（＋）－5rolGLP－HV进行基因测序，结果表明，5rolGLP－HV－His碱基序列构建正确.

图2 琼脂糖凝胶电泳分析5rolGLP－HV－His PCR扩增（A）和pET22b（＋）－5rolGLP－HV 质粒酶切鉴定（B）结果Fig.2 Agar electrophoresis result of 5rolGLP－HVfusion gene amplified by PCR （A）and recombinant plasmid pET22b（＋）－5rolGLP－HVdigested with digestion（B）

3.2 5rolGLP－HV的表达及Western blot鉴定

诱导12h的表达产物经质量分数为12%的SDS－PAGE分析，在分子量约24 000处可见特异的目的蛋白表达条带，未经诱导的重组菌无此条带（图3（A））.诱导后的菌体超声破碎后沉淀和上清液经质量分数为12%的SDS－PAGE分析，考马斯亮蓝染色后，目的蛋白几乎全部在上清液中，经蛋白电泳分析软件扫描显示，在上清液中表达的目的蛋白约占总蛋白的12%（图3（A））.Western blot鉴定表明，目的蛋白与小鼠抗人的GLP－1单克隆抗体有特异性反应（图3（B））.

图3 E.coli BL21（DE3）／5rolGLP－HV表达产物经质量分数为12%的SDS－PAGE鉴定（A）和 Western blot鉴定（B）结果Fig.3 12%SDS－PAGE analysis results of the induction products of E.coli BL21（DE3）／5rolGLP－HV（A）and Western blot identification results of 5GLP－HV（B）

菌体破碎后，将上清液流经Ni－NTA柱亲和层析，在含250mmol／L咪唑的Tris－HCl缓冲液中洗下目的蛋白，收集蛋白并进行SDS－PAGE分析，结果如图4所示.由图4可见，在第4泳道存在单一的目的条带，表明5rolGLP－HV的纯度较高.Bradford分析结果表明，蛋白的产率为25mg／L.

3.3 5rolGLP－HV对小鼠空腹血糖的影响

用STZ诱导的Ⅱ型糖尿病小鼠检测5rolGLP－HV的降糖活性功能，结果如图5所示.由图5可见，正常组小鼠的血糖值变化较小，约为4.8mmol／L；阴性对照组小鼠血糖3周后由16.31mmol／L上升至20.21mmol／L，上升23.8%（p＜0.01）；阳性药（二甲双胍）组小鼠在灌胃第一周血糖下降较快，从16.03mmol／L下降至11.75mmol／L，下降26.7%（p＜0.01），灌胃第二周血糖略有上升，第三周血糖下降至10.82mmol／L，下降32.5%（p＜0.01）；rolGLP－1和5rolGLP－HV灌胃组小鼠在灌胃第一周血糖均下降较快，分别从17.77mmol／L和18.12mmol／L下降至15.07mmol／L和16.03mmol／L，分别下降15.2%（p＜0.01）和11.53%（p＜0.01），灌胃第二周血糖值均呈上升趋势，但上升较慢，灌胃第三周血糖分别降至14.68mmol／L和14.3mmol／L，分别下降17.39%（p＜0.01）和21.08%（p＜0.01）；灌胃3周后，5rolGLP－HV 灌胃组比rolGLP－1灌胃组的降糖效果好（p＜0.05）.

图4 纯化前后促胰岛素水蛭素（5rolGLP－HV）的SDS－PAGE电泳分析结果Fig.4 SDS－PAGE analysis result of purified 5rolGLP－HV

图5 5rolGLP－HV对Ⅱ型糖尿病小鼠空腹血糖的影响Fig.5 Effect of 5rolGLP－HV on fasting blood glucose in typeⅡdiabetic mice

3.4 5rolGLP－HV抗血栓效果

本文采用一种无创性小鼠体内血栓动物模型研究5rolGLP－HV的抗凝活性，通过观察其尾部血栓出现的时间及程度（即相对长度）判断5rolGLP－HV抗血栓效果，结果如图6所示.由图6可见：灌胃生理盐水的对照组小鼠和5rolGLP－HV组小鼠在分别注射卡拉胶约24h和32h后尾部均出现明显的血栓；对照组和5rolGLP－HV组小鼠尾部血栓形成的相对长度分别为（55.2±2.1）%和（29.6±2.7）%.

图6 小鼠尾部血栓形成的测量结果Fig.6 Results of thromboplastic length of the mice’s tail blood

综上所述，本文构建了E.coli BL21（DE3）pET22b（＋）－5rolGLP－HV工程表达菌株.经IPTG诱导菌体破碎后，目的蛋白在上清液中的表达量约占总蛋白的12%，其上清液经Ni－NTA柱亲和层析用含250mmol／L咪唑的Tris－HCl缓冲液洗脱即可获得较高纯度的5rolGLP－HV，产率为25mg／L.动物实验结果表明，5rolGLP－HV具有较好的降糖和抗血栓效果.

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